Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
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Les auteurs remercient Mohamed Abdullahi Ahmed pour l'assistance d'un technicien expert. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Lundbeck, de la Fondation Novo Nordisk, de l'Association danoise du rein, de la Fondation Aase og Ejnar Danielsen, de la Fondation A.P. M'ller pour l'avancement des sciences médicales, et de Knud et Edith Eriksen. Fondation Memorial.

1. Insertion de peptide Coding Séquence de séquençage dans pBAD BirA-eCPX-AP
REMARQUE: Pour sélectionner pour les variantes de BirA qui biotinylate une protéine cible indigène, commencez par identifier une séquence de peptide d'acide 15-amino dans la séquence primaire de protéines qui contient au moins un résidu de lysine (K).
<ol><li>Allez à la suite de manipulation de séquence12.</li>
	<li>Collez la séquence de peptide de 15 acides amin...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Comme pour toutes les méthodes de sélection, la rigueur des étapes de lavage est de la plus haute importance. Étant donné que les bactéries n'ont pas besoin d'être élifiées des perles avant l'amplification des clones sélectionnés, la liaison à forte affinité entre la biotine et la streptavidine peut être utilisée au lieu d'utiliser des avidins à faible affinité, comme cela a déjà été fait avec le système d'affichage des phages, pour la sélection des variantes BirA7,</su...

La biotinylation d'une protéine crée une étiquette puissante pour son isolement et sa détection d'affinité. La biotinylation des protéines enzymatiques est une modification post-traduction très spécifique catalysée par des ligases biotine-protéines. La ligase de biotine-protéine E. coli BirA est extrêmement spécifique et ne biotinylates covalently qu'un nombre restreint de protéines naturelles à des résidus spécifiques de lysine1. Les avantages de la biotinylation catalysée De BirA sont actuellement exploités en fusionnant la protéine cible avec un petit peptide synthétique de biotine de biotine à 15 amino-acides (AP) qui est effectivement biotinylated2 et permet le très spécifique et biotinylation efficace in vivo et in vitro par co-expression ou ajout de BirA3,4,5. Bien que la ligature biotine-protéine catalysée in vivo et in vitro de BirA soit une stratégie d'étiquetage attrayante, son application se limite aux échantillons qui contiennent des protéines fusionnées par ap. Le but de cette méthode est le développement de nouveaux mutants de ligases biotine-protéine qui biotinylate sélectivement protéines indigènes non modifiées et, ce faisant, augmenter le nombre d'applications dans lesquelles la stratégie de biotinylation enzymatique peut être utilisé.
La fonction protéique peut être évoluée par des cycles itératifs de la mutation, de la sélection et de l'amplification des variantes génétiques avec la fonction désirée. Une stratégie de sélection forte et efficace est cruciale pour l'évolution dirigée et l'activité de ligase biotine-protéine est facilement sélectionnée en raison de la forte liaison entre la biotine et la streptavidine et ses homologs6. Les technologies d'affichage des phages permettent la sélection de phages qui présentent des peptides biotinylated7,8. Puisque l'amplification des phages isolés exige l'infection d'un hôte bactérien, cependant, la sélection de phage avec la streptavidine crée un goulot d'étranglement en ce que la liaison à haute affinité de la biotine à la streptavidine est pratiquement irréversible sous non-dénaturation Conditions. Pour assurer la liaison réversible des phages biotinylated, les avidins monomeric avec l'affinité inférieure ont été employés qui ont eu comme conséquence un modeste enrichissement de 10 fois7. Nous avons récemment développé une méthode d'affichage bactérien pour l'isolement des nouvelles variantes BirA qui élimine la nécessité de l'élution de la matrice d'affinité et élimine ainsi un goulot d'étranglement des systèmes de sélection BirA précédents9. En effet, notre système d'affichage bactérien permet un enrichissement de clones actifs en une seule étape de sélection9,offrant ainsi un système de sélection efficace pour l'évolution dirigée de nouvelles variantes de BirA.
Notre système d'affichage bactérien se compose de deux composants, BirA avec une étiquette C-terminal 6xHis et une protéine d'échafaudage qui permet l'affichage de surface d'un peptide cible. Nous avons utilisé la protéine d'échafaudage augmentée circulairement permutée protéine de membrane externe X (eCPX) puisque l'affichage efficace des peptides peut être observé à la fois à la N- et C-termini10,11. La fusion de la séquence de peptide cible au terminus C de l'eCPX assure la biotinylation des bactéries exprimant des variantes actives de BirA. Les bactéries permettent la sélection efficace de streptavidin que le peptide biotinylated affiche maintenant sur la surface (figure 1a).
Le but de cette méthode est de sélectionner pour de nouvelles variantes de BirA qui biotinylates séquences peptidiques présentes dans les protéines indigènes. Le système est encodé par des gènes présents sur le plasmique pBAD-BirA-eCPX-AP, qui contient un promoteur arabinose-inductible contrôlant BirA (araBAD), et un promoteur T7 contrôlant eCPX9 (Figure 1b). Le protocole actuel décrit la procédure détaillée pour 1) l'incorporation d'un peptide dérivé d'une protéine cible dans le C-terminal d'eCPX, 2) la création d'une bibliothèque mutationnelle de BirA par PCR sujette aux erreurs, 3) sélection de bactéries liant la streptavidine par tri cellulaire activé magnétique (MACS), 4) quantification de l'enrichissement des bactéries et 5) caractérisation initiale des clones isolés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

La biotine est une modification post-traductionnelle attrayante des protéines qui fournit une étiquette puissante pour l'isolement et la détection des protéines. La biotinylation enzymatique par la ligase de biotine-protéine E. coli BirA est très spécifique et permet la biotinylation des protéines cibles dans leur environnement indigène ; cependant, l'utilisation actuelle de la biotinylation médiée par BirA nécessite la présence d'un peptide accepteur synthétique (AP) dans la protéine cible. Par conséquent, son application est limitée aux protéines qui ont été conçues pour contenir l'AP. Le but du protocole actuel est d'utiliser l'affichage bactérien d'un peptide dérivé d'une protéine cible non modifiée pour sélectionner pour les variantes de BirA qui biotinylates le peptide. Le système est basé sur un plasmide unique qui permet la co-expression des variantes BirA avec un échafaudage pour l'affichage peptide sur la surface bactérienne. Le protocole décrit une procédure détaillée pour l'incorporation du peptide cible dans l'échafaudage d'affichage, la création de la bibliothèque BirA, la sélection des variantes actives de BirA et la caractérisation initiale des variantes isolées de BirA. La méthode fournit un système de sélection très efficace pour l'isolement de nouvelles variantes BirA qui peuvent être utilisés pour l'évolution dirigée des ligases biotine-protéines qui biotinylate une protéine indigène dans des solutions complexes.

La tache occidentale des bactéries exprimant pBAD-BirA-eCPX-AP produit une bande de streptavidin-réaction de 22 kDa compatible avec le poids moléculaire d'eCPX (Figure 2a). Contrairement à BirA-6xHis, l'eCPX-AP biotinylated était présent dans les cultures non induites et induites (Figure 2a) due à un petit degré d'activité de promoteur de T7 même dans les cultures non induites et à la biotinylation suivante de l'AP pa...

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Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Ici, nous présentons une méthode pour sélectionner pour de nouvelles variantes de la bitine-protéine E. coli ligase BirA qui biotinylates un peptide cible spécifique. Le protocole décrit la construction d'un plasmide pour l'affichage bactérien du peptide cible, la génération d'une bibliothèque BirA, la sélection et la caractérisation des variantes de BirA.

Affichage bactérien de Peptide pour la sélection des enzymes de biotinylating de roman

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Ce protocole fournit un système d’affichage bactérien très efficace pour l’isolement des nouvelles variantes de BirA qui permet une biotinylation spécifique des protéines indigènes. Le principal avantage de la technique est qu’elle sélectionne des variantes BirA en utilisant la sélection de streptavidine à haute affinité. Cela garantit que les clones inactifs sont supprimés, créant ainsi un processus de sélection très efficace.Pour commencer, dans un éditeur plasmide, concevoir l’amorce avant pour inclure les 30 derniers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique, et ajouter la séquence de nucléotide liant plasmide à son extrémité à cinq premiers. Concevoir l’amorce inverse pour inclure les 30 premiers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique, et ajouter la séquence de nucléotide liant plasmide à son extrémité à cinq premiers. Ensuite, pour configurer une réaction PCR de 20 microlitres, ajoutez les réacolteurs dans un tube PCR à paroi mince.Transférez le tube à un cycleur thermique et effectuez pcr selon le manuscrit. Ensuite, exécutez cinq microlitres de la réaction PCR sur un gel agarose de 1% pour confirmer l’amplification d’un produit PCR de six kilobases, et procéder selon le manuscrit. Maintenant, pour synthétiser les mégaprimeurs mutants avec bira hexahistidine avant et arrière amorces, dans un tube PCR, ajouter un nanogramme de pBAD-BirA-eCPX avec la séquence peptidique cible préparée comme un modèle.Configurer 35 cycles PCR avec une température d’annealing de 60 degrés Celsius selon les instructions du fabricant. Ensuite, exécutez cinq microlitres de la réaction d’amplification sur un gel d’agarose de 1% pour vérifier l’amplification d’un produit PCR de paire de 984-base. Purifier le produit PCR des 45 microlitres restants de la réaction d’amplification à l’aide d’un kit commercial de purification pcr, et utiliser un spectrophotomètre pour quantifier le rendement en ADN.Dans un tube PCR à parois minces, ajouter les réhésifs dans les mégaprimeurs mutants préparés pour préparer la réaction de l’échantillon. Transférez le mélange de réaction à un cycleur thermique et exécutez le PCR selon le manuscrit. Conserver la réaction d’amplification à quatre degrés Celsius ou sur la glace.Ensuite, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction Dpn1 directement à la réaction d’amplification, et mélangez doucement. Faites tourner le mélange de réaction et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Après deux heures, transformer les cellules E.coli compétentes T7 Express lysY/Iq dans un tube avec deux microlitres de la réaction Dpn1.Tout d’abord, inoculer 100 millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline avec un millilitre de bibliothèque BirA, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec secousses à 200 rpm. Puis, inoculer cinq millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline avec 100 microlitres de la culture nocturne. Incuber pendant deux heures et 30 minutes ou jusqu’à ce que la culture atteigne un OD600 d’environ 0,5.Ensuite, induisez l’expression eCPX et BirA avec 0,2% de poids par volume L-arabinose, IPTG de 100 micromolaires et biotine de 100 micromolaires. Secouez la culture à 200 rpm pendant une heure à 37 degrés Celsius. Centrifuger la culture pendant 10 minutes à 5000 fois g, et enlever le supernatant.Resuspendez les cellules en un millilitre de PBS glacé, et centrifugeuse à 5000 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et réutilisez les cellules dans 400 microlitres de PBS glacé et stockez les cellules sur la glace. Ensuite, transférez 10 microlitres des cellules résuspendues dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté entrée.Conserver sur la glace. Ensuite, lavez 20 microlitres de perles magnétiques streptavidin dans un millilitre de PBS glacé dans un tube, et placez le tube dans un séparateur de particules magnétiques benchtop pendant deux minutes, et retirez soigneusement le supernatant. Resuspendez les perles magnétiques streptavidin dans 20 microlitres de PBS glacé, et transférez la solution de perle aux 390 microlitres préparés précédents des cellules résuspendues.Mélanger en pipetting doucement. Puis, incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Placez une colonne avec des sphères ferrrommagnétiques dans un séparateur de particules magnétiques, et lavez-la avec cinq millilitres de PBS glacé.Transférer les cellules et les perles magnétiques de streptavidine du tube dans la colonne fixée dans le séparateur. Une fois que le réservoir de colonne est vide, lavez la colonne avec un volume total de cinq millilitres de PBS glacé à 500 microlitres à chaque fois. Après cela, retirez la colonne du séparateur et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre.Pipette un millilitre de PBS glacé sur la colonne, et utiliser le piston pour élucider les cellules étiquetées magnétiquement. Ensuite, placez le tube de 1,5 millilitre dans un séparateur de dessus de banc et lavez la cellule étiquetée magnétiquement avec un millilitre de PBS glacé. Resuspendez doucement les cellules étiquetées magnétiquement dans un millilitre du PBS glacé.Transférer 10 microlitres de la resuspension dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté sortie. Inoculer 100 millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par ampicilline millilitre avec les cellules étiquetées magnétiquement, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec secousses à 200 rpm. Le lendemain, combinez 10 millilitres de la culture nocturne en LB avec du glycérol jusqu’à une concentration finale de 15 % et stockez à moins 80 degrés Celsius pour faire des stocks de congélateur.Utilisez 100 microlitres de la culture de nuit pour la prochaine ronde de sélection. Maintenant, ajoutez 990 microlitres de PBS glacé aux échantillons d’entrée et de sortie, et étiquetez les tubes entrée 10 à moins deux et sortie 10 à moins deux, respectivement. Effectuer 10 dilutions périodiques des deux échantillons dans du PBS glacé jusqu’à ce qu’une dilution finale de 10 à moins 10 soit atteinte dans l’échantillon d’entrée et de 10 à moins quatre dans l’échantillon de sortie.Plaque 100 microlitres d’échantillons de l’entrée 10 à la moins six, entrée 10 à moins huit, entrée 10 à moins 10, sortie 10 à moins deux, sortie 10 à moins trois, et sortie 10 à moins quatre sur les plaques individuelles LB-ampicilline, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le matin, comptez le nombre de colonies sur les plaques avec des colonies clairement séparées. Multipliez le nombre de colonies avec le facteur de dilution pour obtenir le nombre de concentrations bactériennes par 100 microlitres.Dans ce protocole, après génération d’une bibliothèque mutée aléatoirement des variantes de BirA, l’expression de BirA et d’eCPX-AP a été induite. Des bactéries ont été incubées avec le réagent d’affinité, des bactéries non liées ont été jetées, et des bactéries choisies ont été amplifiées. La tache occidentale de bactéries exprimant pBAD-BirA-eCPX-AP a produit une bande streptavidine-réaction de 22 kilodalton compatible avec le poids moléculaire de l’eCPX dans les cultures non induites et induites.Cependant, ils n’étaient pas présents dans bira hexahistidine. La biotinylation de surface forte dans les bactéries exprimant eCPX-AP a causé l’agrégation sur l’addition des perles magnétiques de streptavidine et la formation d’une pastille au fond du tube, qui n’a pas été observée avec eCPX avec la lysine aux bactéries d’expression de mutation d’alanine. L’analyse du précipité du retrait de streptavidin a montré un dégagement clair de 22 kilodalton streptavidin-réaction et bande anti-hexahistidine dans les échantillons des cultures d’eCPX-AP mais pas eCPX-AP avec la lysine aux cultures de mutation d’alanine.De même, le nombre de bactéries liées aux perles de streptavidine était significativement plus élevé dans l’eCPX-AP que la lysine eCPX-AP aux cultures de mutation d’alanine. L’étape la plus importante est un lavage rigoureux des bactéries liées à la streptavidine. Un lavage rigoureux garantit que seules les bactéries avec de la biotine affichée en surface sont sélectionnées.Une fois qu’un enrichissement clair des bactéries est observé, les clones isolés peuvent être mutés davantage et ainsi développer des variantes bira très actives qui permettent une biotinylation spécifique des protéines indigènes.

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