Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

המחברים מודים למוחמד ליוהי אחמד על הסיוע של טכנאי מומחה. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מקרן לוננבק, קרן נובו נורדיסק, אגודת הכליות הדנית, קרן הכליה והDanielsen, הקרן לקידום מדעי הרפואה וקנוד ואדית אריקסן . קרן הזיכרון

1. החדרת רצף פפטיד קידוד בתוך pBAD בירה-eCPX-AP
הערה: כדי לבחור עבור משתני בירה כי biotinylate איחור חלבון מטרה מקורית, להתחיל על ידי זיהוי רצף פפטיד 15-אמינו ברצף החלבונים העיקרי המכיל לפחות אחד ליזין (K) שאריות.
<ol><li>. לך לסוויטה מניפולציה12</li>
	<li>מדביקים את הרצף המז?...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

באשר לכל שיטות הבחירה, החשיבות הרבה ביותר היא לשטוף את צעדי הכביסה. מאז חיידקים לא צריך להיות חומק מן החרוזים לפני הגברה של שיבוטים שנבחרו, כריכת זיקה גבוהה בין ביוטין ו streptavidin יכול לשמש במקום באמצעות avidins אהדה נמוכה, כפי שנעשה בעבר עם מערכת התצוגה phage, עבור מבחר משתני בירה7,</s...

ביוטילציה של חלבון יוצר תגית רבת עוצמה לבידוד ולגילוי האהדה שלו. ביוטילציה חלבון אנזימטית הוא שינוי מיוחד ביותר שלאחר השינוי באמצעות חלבון ביולוגי. ה- E. coli ביוטין-חלבון ליגאז בירה הוא מאוד ספציפי ומאוד biotinylates רק מספר מוגבל של חלבונים המתרחשים באופן טבעי על שאריות ליזין ספציפי1. היתרונות של הביוטילציה של הבירה מכוונים כיום על ידי החדרת חלבון היעד באמצעות ביוטין (AP) קטן מלאכותי של 15-חומצות אמינו ביולוגי-פפטיד, שהוא ביולוגי הביוטיליס2 ומאפשר את הספציפי וה יעיל בvivo ובביוטילציה על ידי ביטוי משותף או תוספת של בירה3,4,5. למרות vivo ו בירה מחוץ למבחנה ביוטין-חלבון לחות היא אסטרטגיה מושכת תיוג, היישום שלה מוגבל דגימות המכילות חלבונים AP-התמזגו. מטרת שיטה זו היא התפתחות של מוטציות חדשות של ביוטין-חלבון ליגסים, כי באופן סלקטיבי ביולוגי מקורי חלבונים שאינם שונו, ובכך להרחיב את מספר היישומים בהם ניתן להשתמש באסטרטגיית הביוטילציה האנזימטית.
פונקציית חלבון ניתן להתפתח באמצעות סיבובים איטרטיביים של מוטציה גן, בחירה, הגברה של משתני גנים עם הפונקציה הרצויה. אסטרטגיה בחירה חזקה ויעילה היא חיונית עבור האבולוציה המנותבת ו ביוטין-חלבון ליגאז הפעילות מסומנת בקלות בשל הכריכה חזקה בין ביוטין ו streptavidin ו הומויומנים שלה6. טכנולוגיית התצוגה phage לאפשר את הבחירה של phage המציגות פפטידים biotinylated7,8. מאז הגברה של phages מבודדים דורש זיהום של מארח בקטריאלי, עם זאת, בחירת phages עם streptavidin יוצר צוואר בקבוק כי איגוד האהדה הגבוהה של ביוטין לstreptavidin הוא כמעט בלתי הפיך תחת לא מודצות תנאים. כדי להבטיח את הכריכה ההפיכה של phages ביולוגית, השתמשו במונמאריק אבידינס עם זיקהנמוכה יותר,שהביאה לעשרה בעלי קיפול צנוע של 10%. פיתחנו לאחרונה שיטת תצוגה בקטריאלי לבידוד של משתני בירה החדשניים המבטלת את הצורך להתחמק ממטריצת הזיקה ובכך מסירה צוואר בקבוק ממערכות הבחירה הקודמות9. אכן, מערכת התצוגה החיידקית שלנו מאפשרת ל> 1, 000, 000-קיפול של שיבוטים פעילים בשלב בחירה יחיד9, ובכך לספק מערכת בחירה יעילה עבור האבולוציה מכוונת של משתני בירה הרומן.
מערכת התצוגה החיידקית שלנו מורכבת משני מרכיבים, בירה עם תג C-טרמינל 6xHis וחלבון הגרדום המאפשר להציג את המשטח של פפטיד מטרה. השתמשנו בחלבון הפיגום מעגלי משופרת מעגליות חלבון ממברנה החיצוני X (eCPX) מאז התצוגה האפקטיבית של פפטידים ניתן לצפות הן N-ו-C-termini10,11. המיזוג של רצף פפטיד היעד ל C-הטרמינוס של eCPX מבטיח ביוקטילציה של חיידקים המבטאים משתני בירה פעילים. החיידק מאפשר בחירה streptavidin אפקטיבית כמו פפטיד ביולוגי מוצג כעת על פני השטח (איור 1א).
מטרת שיטה זו היא לבחור לגרסאות החדשניים של בירה כי רצפי פפטיד biotinylates קיימים בחלבונים יליד. המערכת מוצפנת על ידי הגנים הנמצאים על pBAD-בירה-eCPX-AP, אשר מכיל את השליטה arabinose-inducible יזם שליטה בירה (araBAD), ומקדם T7 השליטה eCPX9 (איור 1b). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליך המפורט 1) התאגדות של פפטיד שנגזר חלבון היעד לתוך C-מסוף של eCPX, 2) יצירה של ספריית משנה של בירה על ידי נטייה לשגיאות PCR, 3) מבחר של חיידקים streptavidin-binding על ידי מיון תא מגנטי מופעל (מקינטוש), 4) קוונפיקציה של חיידקים העשרה, ו 5) האפיון הראשוני של שיבוטים מבודדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotin הוא שינוי אטרקטיבי לאחר השינוי של חלבונים המספקת תג רב עוצמה עבור בידוד וזיהוי של חלבון. הביונילציה האנזימטית ע י החיידק הביוטין-ליאג-חלבון הוא מאוד ספציפי ומאפשר לביוטילציה של חלבונים מטרה בסביבתם הטבעית; עם זאת, השימוש הנוכחי של ביוקטילציה בירה מצריך נוכחות של פפטיד סינתטי (AP) בחלבון היעד. לכן, היישום שלו מוגבל לחלבונים שעברו הנדסה כדי להכיל את ה-AP. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להשתמש בתצוגה החיידקית של פפטיד שנגזר מחלבון מטרה שאינו שינה לבחור עבור משתני בירה שביוטיטים את הפפטיד. המערכת מבוססת על פלסמיד יחיד המאפשר ביטוי משותף של משתני בירה יחד עם פיגום לתצוגה פפטיד על פני החיידקים. הפרוטוקול מתאר הליך מפורט לשילוב פפטיד היעד לפיגום התצוגה, יצירת ספריית בירה, מבחר משתני בירה פעילים ואפיון ראשוני של משתני בירה מבודדים. השיטה מספקת מערכת בחירה יעילה ביותר לבידוד של משתני בירה חדשניים, שניתן להשתמש בהם להתפתחות מכוונת נוספת של ביוטין-חלבון, אשר בbiotinylate אוחר יותר חלבון מקורי בפתרונות מורכבים.

הכתם המערבי של pBAD-בירה-eCPX-AP להביע חיידקים מייצרת ~ 22 kDa streptavidin-הלהקה הגיבה בעקביות עם המשקל המולקולרי של eCPX (איור 2א). בניגוד לבירה-6xHis, eCPX ביולוגית-AP היה נוכח בתרבויות שאינן המושרה והמושרה (איור 2א) בשל מידה קטנה של פעילות T7 יזם גם בתרבויות שאי...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

פרוטוקול זה מספק מערכת תצוגה חיידקית יעילה מאוד לבידוד של גרסאות חדשות של BirA המאפשר biotinylation ספציפי של חלבונים מקומיים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא בוחרת גרסאות BirA באמצעות בחירת סטרפטבידין זיקה גבוהה. פעולה זו מבטיחה הסרת שיבוטים לא פעילים, ובכך יוצרת תהליך בחירה יעיל ביותר.כדי להתחיל, בעורך פלסמיד, עצב את פריימר קדימה כך שיכלול את 30 הנוקלאוטידים האחרונים של המשלים ההפוך של רצף הקידוד של הפפטיד, והוסף את רצף הנוקלאוטידים הכריכה הפלסמידית לקצה חמשת הפריימים שלו. עצבו את פריימר ההפוך כך שיכלול את 30 הנוקלאוטידים הראשונים של המשלים ההפוך של רצף הקידוד של הפפטיד, והוסיפו את רצף הנוקלאוטידים הכריכה הפלסמידית לקצה חמשת הפריימים שלו. לאחר מכן, כדי להגדיר תגובת PCR של 20 מיקרוליטר, הוסף את ריאגנטים בצינור PCR דק קיר.מעבירים את הצינור לעגלה תרמית, ולבצע PCR על פי כתב היד. לאחר מכן, הפעל חמישה מיקרוליטרים של תגובת PCR על ג'ל 1%agarose כדי לאשר את ההגברה של מוצר PCR שישה קילו-באז, ולהמשיך על פי כתב היד. עכשיו, כדי לסנתז את מגה-פרימרים מוטנטים עם BirA hexahistidine קדימה ו פריימרים הפוכים, בצינור PCR, להוסיף ננוגרם אחד של pBAD-BirA-eCPX עם רצף פפטיד היעד מוכן כתבנית.הגדר 35 מחזורי PCR עם טמפרטורת חישול של 60 מעלות צלזיוס על פי הוראת היצרן. לאחר מכן, הפעל חמישה מיקרוליטרים של תגובת ההגברה על ג'ל 1%agarose כדי לאמת את ההגברה של מוצר PCR 984 בסיס. לטהר את המוצר PCR מ 45 microliters הנותרים של תגובת הגברה באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית, ולהשתמש ספקטרופוטומטר לכמת את תשואת ה-DNA.בצינור PCR דק קירות, מוסיפים את ריאגנטים מגה-פרימרים מוטנטים מוכנים כדי להכין את תגובת המדגם. מעבירים את תערובת התגובה למחזור תרמי, ולהפעיל את PCR על פי כתב היד. אחסן את תגובת ההגברה בארבע מעלות צלזיוס או על קרח.לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלת Dpn1 ישירות לתגובת ההגברה, ומערבבים בעדינות. מסובבים את תערובת התגובות, ומטמיבים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, להפוך T7 אקספרס lysY / Iq מוכשר E.coli תאים בצינור עם שני microliters של תגובת Dpn1.ראשית, לחסן 100 מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין עם מיליליטר אחד של ספריית BirA, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. לאחר מכן, לחסן חמישה מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין עם 100 microliters של תרבות הלילה. דגירה במשך שעתיים ו 30 דקות או עד התרבות מגיעה OD600 של כ 0.5.לאחר מכן, לגרום ביטוי eCPX ו BirA עם 0.2% משקל לפי נפח L-arabinose, 100 מיקרומולר IPTG, ו 100 מיקרומולר ביוטין. לנער את התרבות ב 200 סל"ד במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התרבות במשך 10 דקות ב 5, 000 פעמים גרם, ולהסיר את supernatant.תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים ב-400 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח, ואחסנו תאים על קרח. לאחר מכן, העבר 10 מיקרוליטרים של התאים המתווכים מחדש לתוך צינור 1.5 מיליליטר שכותרתו קלט.חנות על קרח. לאחר מכן, לשטוף 20 microliters של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין במיליליטר אחד של PBS קר כקרח בצינור, ולמקם את הצינור במפריד חלקיקים מגנטיים על הספסל במשך שתי דקות, ולהסיר בזהירות את supernatant. תוכלו להשתמש מחדש ב-20 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח, ולהעביר את פתרון חרוזים ל-390 המיקרוליטרים הקודמים של תאים מתווסלים.מערבבים על ידי צינורות בעדינות. ואז, דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מניחים עמוד עם כדורים פרומגנטיים במפריד חלקיקים מגנטיים, ולשטוף עם חמישה מיליליטר של PBS קר כקרח.מעבירים את התאים ואת חרוזים מגנטיים סטרפטבידין מהצינור לתוך העמוד המחובר במפריד. לאחר מאגר העמודים ריק, לשטוף את העמוד עם נפח כולל של חמישה מיליליטר של PBS קר כקרח ב 500 microliters בכל פעם. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמפריד והצב אותה בצינור של 1.5 מיליליטר.פיפטה מיליליטר אחד של PBS קר כקרח על העמוד, ולהשתמש בוכנה כדי לחמק התאים המסווים מגנטית. לאחר מכן, מניחים את הצינור 1.5 מיליליטר לתוך מפריד ספסל, ולשטוף את התא שכותרתו מגנטית עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח. יש לעכל בעדינות את התאים המסווים מגנטית במיליליטר אחד של ה-PBS הקר כקרח.העבר 10 מיקרוליטרים של ההתעברות לתוך צינור 1.5 מיליליטר שכותרתו פלט. לחסן 100 מיליליטר של LB המכיל 1%גלוקוז ו 100 מיקרוגרם לאמפיצילין מיליליטר עם תאים המסומנים מגנטית, ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל"ד. למחרת, לשלב 10 מיליליטר של תרבות הלילה ב LB עם גליצרול לריכוז סופי של 15% ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להפוך את מלאי המקפיא.השתמש 100 microliters של תרבות הלילה לסיבוב הבא של הבחירה. עכשיו, להוסיף 990 microliters של PBS קר כקרח הן את דגימות הקלט והפלט, ולתייג את הצינורות קלט 10 למינוס שתיים ותפוקה 10 למינוס שתיים, בהתאמה. בצע דילול סדרתי פי 10 של שתי הדגימות ב- PBS קר כקרח עד לדילול סופי של 10 למינוס 10 בדגימה הקלט ו -10 למינוס ארבע בדגימה של הפלט.צלחת 100 microliters של דגימות מקלט 10 כדי מינוס שש, קלט 10 למינוס שמונה, קלט 10 למינוס 10, פלט 10 למינוס שתיים, פלט 10 למינוס שלוש, ותפוקה 10 למינוס ארבע על לוחות LB-ampicillin בודדים, ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בבוקר, לספור את מספר המושבות על הלוחות עם מושבות מופרדות בבירור. הכפל את ספירת המושבות עם גורם הדילול כדי להשיג את ספירת ריכוז החיידקים לכל 100 מיקרוליטרים.בפרוטוקול זה, לאחר יצירת ספרייה שעברה מוטציה אקראית של גרסאות BirA, ביטוי BirA ו- eCPX-AP היה המושרה. חיידקים הודגרו עם זיקה בריאגנט, חיידקים לא מאוגדים הושלכו, וחיידקים נבחרים הוגברו. כתם מערבי של pBAD-BirA-eCPX-AP המביעים חיידקים הפיק רצועה 22 קילודלטון סטרפטבידין בתגובה עולה בקנה אחד עם המשקל המולקולרי של eCPX הן תרבויות לא מיושר ומושרה.עם זאת, הם לא היו נוכחים בהקסהיסטידין BirA. ביוטינילציה משטח חזק eCPX-AP הבעת חיידקים גרמה צבירה על תוספת של חרוזים מגנטיים סטרפטבידין היווצרות גלולה בתחתית הצינור, אשר לא נצפתה עם eCPX עם ליסין לחיידק ביטוי מוטציה אלנין. ניתוח של המשקע מן ההתכווצות סטרפטבידין הציג ברור 22 קילודלטון סטרפטוודין-תגובה אנטי הקסהיסטידין הלהקה בדגימות מתרבויות eCPX-AP אבל לא eCPX-AP עם ליסין לתרבויות מוטציה אלנין.באופן דומה, ספירת החיידקים הקשורים חמוזי סטרפטבידין היה גבוה באופן משמעותי eCPX-AP מאשר ליסינוס eCPX-AP לתרבויות מוטציה אלנין. הצעד החשוב ביותר הוא שטיפה מחמירה של חיידקים הקשורים סטרפטבידין. כביסה מחמירה מבטיחה כי רק חיידקים עם ביוטין המוצג על פני השטח נבחרים.לאחר העשרה ברורה של חיידקים הוא ציין, שיבוטים מבודדים ניתן לשנות עוד יותר ובכך לפתח גרסאות BirA פעיל מאוד המאפשרים biotinylation ספציפי של חלבונים מקומיים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...