Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
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लेखकों विशेषज्ञ तकनीशियन सहायता के लिए मोहम्मद अब्दुल्लाई अहमद धन्यवाद. यह काम Lundbeck फाउंडेशन, नोवो Nordisk फाउंडेशन, डेनिश किडनी एसोसिएशन, Aase ओग EZnar डैनियलसन फाउंडेशन, चिकित्सा विज्ञान की उन्नति के लिए ए.पी. मेलर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और Knud और Edith एरिकसन मेमोरियल फाउंडेशन.

1. PBAD BirA-eCPX-AP में पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम अनुक्रम की प्रविष्टि
नोट: BirA वेरिएंट है कि biotinylate एक देशी लक्ष्य प्रोटीन के लिए चयन करने के लिए, प्रोटीन प्राथमिक अनुक्रम है कि कम से कम एक lysine (कश्मीर) अव?...

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	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. 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सभी चयन विधियों के लिए के रूप में, कपड़े धोने के चरणों की कठोरता अत्यंत महत्वपूर्ण है. चूंकि बैक्टीरिया चयनित क्लोन के प्रवर्धन से पहले मोती से eluted होने की जरूरत नहीं है, biotin और streptavidin के बीच उच्च आत्मीयता बं...

एक प्रोटीन के Biotinylation अपनी आत्मीयता अलगाव और पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग बनाता है. एंजाइमी प्रोटीन बायोटिनिलेशन बायोटिन प्रोटीन लिगैस द्वारा उत्प्रेरित एक अत्यधिक विशिष्ट पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है। ई. कोलाई बायोटिन प्रोटीन लिगासे बिरा अत्यंत विशिष्ट और सहसंयोजक रूप से बायोटिनलेट केवल विशिष्ट lysine अवशेषों1पर स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रोटीन की एक प्रतिबंधित संख्या है। BirA उत्प्रेरित biotinylation के लाभ वर्तमान में एक छोटे से सिंथेटिक 15-एमिनो-एसिड बायोटिन स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) है कि प्रभावी रूप से biotinylated2 है और अत्यधिक विशिष्ट के लिए अनुमति देता है के साथ लक्ष्य प्रोटीन fusing द्वारा उपयोग कर रहे हैं और अत्यधिक विशिष्ट और के लिए अनुमति देता है विवो में कुशल और सह-अभिव्यक्ति या बीरए 3,4,5के अलावा द्वारा इन विट्रो बायोटिनिलेशन में । हालांकि इन विवो और इन विट्रो BirA उत्प्रेरित बायोटिन प्रोटीन लिगेशन एक आकर्षक लेबलिंग रणनीति है, इसके आवेदन के नमूने है कि एपी-फ्यूजप्रोटीन होते हैं करने के लिए सीमित है। इस विधि का उद्देश्य बायोटिन प्रोटीन ligases के नए म्यूटेंट का विकास है जो चुनिंदा biotinylate देशी असंशोधित प्रोटीन और, जिससे अनुप्रयोगों की संख्या का विस्तार जिसमें एंजाइमी biotinylation रणनीति इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रोटीन समारोह जीन उत्परिवर्तन, चयन, और वांछित समारोह के साथ जीन वेरिएंट के प्रवर्धन के पुनरावर्ती दौर के माध्यम से विकसित किया जा सकता है. एक मजबूत और कुशल चयन रणनीति निर्देशित विकास के लिए महत्वपूर्ण है और बायोटिन प्रोटीन लिगेस गतिविधि आसानी से बायोटिन और स्ट्रेप्टाविडिन और उसके समलॉग6के बीच मजबूत बंधन के कारण चुना जाता है। फैग प्रदर्शन प्रौद्योगिकियों phages के चयन के लिए अनुमति देते हैं कि biotinylated पेप्टाइड्स7,8प्रदर्शित करते हैं . चूंकि अलग phages के प्रवर्धन के लिए एक जीवाणु मेजबान के संक्रमण की आवश्यकता होती है, हालांकि, स्ट्रेप्टाविडिन के साथ फैज चयन में एक बाधा पैदा करता है जिसमें बायोटिन के स्ट्रेपविडिन के लिए उच्च-एफ़िनिटी बाइंडिंग गैर-डेनिंग के तहत लगभग अपरिवर्तनीय है शर्तों. biotinylated phages के प्रतिवर्ती बंधन सुनिश्चित करने के लिए, कम आत्मीयता के साथ monomeric avidins का उपयोग किया गया जिसके परिणामस्वरूप एक मामूली $ 10 गुना संवर्धन7. हमने हाल ही में उपन्यास बीरा रूपों के अलगाव के लिए एक जीवाणु प्रदर्शन विधि विकसित की है जो आत्मीयता मैट्रिक्स से अधिक्युशन की आवश्यकता को समाप्त करती है और इस प्रकार पिछले बीरा चयन प्रणालियों9से एक अवरोध को दूर करती है . वास्तव में, हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली एक एकल चयन चरण9में सक्रिय क्लोन के एक gt;1,000,000 गुना संवर्धन के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार उपन्यास BirA वेरिएंट के निर्देशित विकास के लिए एक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान.
हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली दो घटकों के होते हैं, एक सी-टर्मिनल 6xHis टैग और एक पाड़ प्रोटीन है कि एक लक्ष्य पेप्टाइड की सतह प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है के साथ BirA. हम पाड़ प्रोटीन बढ़ाया परिपत्र permuted बाहरी झिल्ली प्रोटीन एक्स (eCPX) के बाद से पेप्टाइड्स के प्रभावी प्रदर्शन दोनों एन और सी termini10,11पर मनाया जा सकता है. ईसीपीएक्स के सी-टर्मिनस को टारगेट पेप्टाइड अनुक्रम का संलयन सक्रिय बीरा वेरिएंट को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया का बायोटिनिलेशन सुनिश्चित करता है। बैक्टीरिया प्रभावी स्ट्रेप्टाविडिन चयन के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि बायोटिनलेट पेप्टाइड अब सतह पर प्रदर्शित होता है (चित्र 1क) .
इस विधि का उद्देश्य BirA के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए है कि biotinylates पेप्टाइड दृश्यों देशी प्रोटीन में मौजूद है. इस प्रणाली को प्लाज्मिड पीबीडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी पर मौजूद जीनों द्वारा एनकोडेड किया जाता है, जिसमें एक अरबन-इंसुलेबल प्रमोटर नियंत्रित बीरा (आराबैड) और एक टी 7 प्रमोटर को नियंत्रित करने वाला ईसीपीएक्स9 (चित्र 1ख) होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन 1) eCPX के सी-टर्मिनल में एक लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड का समावेश, 2) त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा बीरा के उत्परिवर्तन पुस्तकालय का निर्माण, 3) स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी बैक्टीरिया का चयन चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (MACS), 4) बैक्टीरिया संवर्धन के परिमाणीकरण, और 5) अलग क्लोन के प्रारंभिक लक्षण.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotin प्रोटीन के एक आकर्षक पोस्ट-अनुवाद संशोधन है कि अलगाव और प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग प्रदान करता है. ई. कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा द्वारा एंजाइमी बायोटिनिलेशन अत्यधिक विशिष्ट है और अपने मूल वातावरण में लक्ष्य प्रोटीन के biotinylation के लिए अनुमति देता है; हालांकि, BirA मध्यस्थता biotinylation के वर्तमान उपयोग लक्ष्य प्रोटीन में एक सिंथेटिक स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) की उपस्थिति की आवश्यकता है. इसलिए, इसके आवेदन एपी को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि प्रोटीन के लिए सीमित है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक असंशोधित लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए BirA वेरिएंट है कि biotinylates पेप्टाइड के लिए चयन करने के लिए है. प्रणाली एक एकल प्लाज्मिड पर आधारित है जो बैक्टीरिया की सतह पर पेप्टाइड प्रदर्शन के लिए पाड़ के साथ-साथ BirA वेरिएंट के सह-अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल प्रदर्शन पाड़ में लक्ष्य पेप्टाइड के समावेश के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, BirA पुस्तकालय के निर्माण, सक्रिय BirA वेरिएंट का चयन और अलग BirA वेरिएंट के प्रारंभिक लक्षण. विधि उपन्यास BirA वेरिएंट है कि biotin प्रोटीन ligases के आगे निर्देशित विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि biotinylate जटिल समाधान में एक देशी प्रोटीन के अलगाव के लिए एक अत्यधिक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान करता है.

पीबीएडी-बिरा-ए-सीसीपीएक्स-एपी का पश्चिमी धब्बा बैक्टीरिया व्यक्त करने से ईसीपीएक्स के आण्विक भार के अनुरूप एक $22 केडीए स्ट्रेप्टाविडिन-प्रतिक्रिया बैंड उत्पन्न होता है (चित्र 2क)। BirA-6...

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Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

यहाँ हम ई कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो बायोटिनलेट एक विशिष्ट लक्ष्य पेप्टाइड को पेश करता है। प्रोटोकॉल लक्ष्य पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन के लिए एक प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करता है, एक BirA पुस्तकालय की पीढ़ी, चयन और BirA वेरिएंट की विशेषता.

उपन्यास Biotinylating एंजाइमों के चयन के लिए बैक्टीरियल पेप्टाइड प्रदर्शन

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

यह प्रोटोकॉल बीरा के उपन्यास वेरिएंट के अलगाव के लिए एक बेहद प्रभावी बैक्टीरियल डिस्प्ले सिस्टम प्रदान करता है जो देशी प्रोटीन के विशिष्ट बायोटिनिलेशन के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह उच्च-आत्मीयता स्ट्रेप्टाविडिन चयन का उपयोग करके बीरा वेरिएंट का चयन करता है। यह सुनिश्चित करता है कि निष्क्रिय क्लोन हटा दिए जाते हैं, इस प्रकार एक अत्यधिक कुशल चयन प्रक्रिया बनाते हैं।शुरू करने के लिए, एक प्लाज्मिड संपादक में, पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम के रिवर्स पूरक के अंतिम 30 न्यूक्लियोटाइड को शामिल करने के लिए फॉरवर्ड प्राइमर डिजाइन करें, और प्लाज्मिड बाइंडिंग न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को अपने पांच-प्राइम एंड में जोड़ें। पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम के रिवर्स पूरक के पहले 30 न्यूक्लियोटाइड को शामिल करने के लिए रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें, और प्लाज्मिड बाध्यकारी न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को अपने पांच-प्राइम एंड में जोड़ें। इसके बाद 20 माइक्रोलिटर पीसीआर रिएक्शन सेट करने के लिए रिएजेंट्स को पतली दीवारों वाली पीसीआर ट्यूब में डालें।ट्यूब को थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें, और पांडुलिपि के अनुसार पीसीआर करें। इसके बाद, छह किलोबेस पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए 1% एगर उठे जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया के पांच माइक्रोलीटर चलाएं, और पांडुलिपि के अनुसार आगे बढ़ें। अब, एक पीसीआर ट्यूब में बीरा हेक्साहिस्टिडीन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के साथ उत्परिवर्ती मेगाप्रिमर्स को संश्लेषित करने के लिए, तैयार लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम के साथ पीबीएडी-बीरा-ईसीपीएक्स का एक नैनोग्राम एक टेम्पलेट के रूप में जोड़ें।निर्माता के निर्देश के अनुसार 60 डिग्री सेल्सियस के एक एनीलिंग तापमान के साथ 35 पीसीआर चक्र स्थापित करें। फिर, 984-बेस जोड़ी पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन को सत्यापित करने के लिए 1% एगर उठे जेल पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के पांच माइक्रोलीटर चलाएं। एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के शेष ४५ माइक्रोलीटर से पीसीआर उत्पाद को शुद्ध, और डीएनए उपज की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें ।पतली दीवारों वाली पीसीआर ट्यूब में, सैंपल रिएक्शन तैयार करने के लिए तैयार उत्परिवर्ती मेगाप्राइमर्स में रिएजेंट्स डालें। एक थर्मल साइकिलर के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरित, और पांडुलिपि के अनुसार पीसीआर चलाते हैं। प्रवर्धन प्रतिक्रिया को चार डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर स्टोर करें।इसके बाद, प्रवर्धन प्रतिक्रिया में सीधे DPn1 प्रतिबंध एंजाइम का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे मिलाएं। प्रतिक्रिया मिश्रण को नीचे स्पिन करें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे तक इनक्यूबेट करें। दो घंटे के बाद, T7 एक्सप्रेस lysY/बुद्धि सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं को एक ट्यूब में बदलें जिसमें Dpn1 प्रतिक्रिया के दो माइक्रोलीटर हैं ।सबसे पहले, बीरा पुस्तकालय के एक मिलीलीटर के साथ एम्पिसिलिन के 1% ग्लूकोज और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त पौंड के 100 मिलीलीटर टीका, और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट। फिर, रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर के साथ एम्पिसिलिन के 1% ग्लूकोज और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त पौंड के पांच मिलीलीटर टीका। दो घंटे और 30 मिनट के लिए या जब तक संस्कृति लगभग 0.5 के एक OD600 तक पहुंचता है।इसके बाद, वॉल्यूम एल-अरेबिनोस, 100-माइक्रोमोलर आईपीटीजी और 100-माइक्रोमोलर बायोटिन द्वारा 0.2% वजन के साथ ईपीएपएक्स और बीरा अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 200 आरपीएम पर संस्कृति को हिलाएं। 5, 000 बार जी पर 10 मिनट के लिए संस्कृति अपकेंद्रित्र, और सुपरनेट को हटा दें।बर्फ के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च-ठंडे PBS, और पांच मिनट के लिए 5, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र । सुपरनैंट को त्यागें, और बर्फ-ठंडे पीबीएस के 400 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और बर्फ पर कोशिकाओं को स्टोर करें। फिर, पुनर्नृण कोशिकाओं के 10 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब लेबल इनपुट में स्थानांतरित करें।बर्फ पर स्टोर करें। इसके बाद, एक ट्यूब में बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर में स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के 20 माइक्रोलीटर धोएं, और ट्यूब को दो मिनट के लिए एक बेंचटॉप चुंबकीय कण विभाजक में रखें, और ध्यान से सुपरनैक्टेंट को हटा दें। बर्फ-ठंडे पीबीएस के 20 माइक्रोलीटर में स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों को फिर से खर्च करें, और पुनः निलंबित कोशिकाओं के पिछले तैयार 390 माइक्रोलीटर के लिए मनका समाधान स्थानांतरित करें।धीरे-धीरे पाइपिंग करके मिलाएं। इसके बाद 30 मिनट तक चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक चुंबकीय कण विभाजक में फेरोमैग्नेटिक क्षेत्रों के साथ एक स्तंभ रखें, और बर्फ के पांच मिलीलीटर के साथ धो-ठंडे PBS ।कोशिकाओं और स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों को ट्यूब से विभाजक में संलग्न कॉलम में स्थानांतरित करें। एक बार कॉलम जलाशय खाली होने के बाद, हर बार ५०० माइक्रोलीटर पर बर्फ-ठंडे पीबीएस के पांच मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ कॉलम धोएं । उसके बाद, सेपरेटर से कॉलम निकालें, और इसे 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।स्तंभ पर बर्फ-ठंडे पीबीएस का एक मिलीलीटर पिपेट, और चुंबकीय लेबल कोशिकाओं को elute करने के लिए प्लंजर का उपयोग करें। फिर, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को एक बेंचटॉप विभाजक में रखें, और चुंबकीय रूप से लेबल वाली कोशिका को बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ धो लें। धीरे-धीरे बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर में चुंबकीय रूप से लेबल कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।आउटपुट लेबल किए गए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पुनर्सपेंशन के 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। चुंबकीय लेबल कोशिकाओं के साथ 1% ग्लूकोज और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पिसिलिन युक्त पौंड के 100 मिलीलीटर टीका, और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट। अगले दिन, 15% की अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लाइसरोल के साथ पौंड में रातोंरात संस्कृति के 10 मिलीलीटर गठबंधन और फ्रीजर स्टॉक बनाने के लिए शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।चयन के अगले दौर के लिए रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें। अब, इनपुट और आउटपुट नमूनों दोनों में बर्फ-ठंडे पीबीएस के 990 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ट्यूबों इनपुट 10 को माइनस दो और आउटपुट 10 को क्रमशः माइनस दो में लेबल करें। बर्फ-ठंड पीबीएस में दो नमूनों के 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने जब तक 10 से माइनस 10 के अंतिम कमजोर पड़ने इनपुट नमूने में पहुंच गया है और उत्पादन नमूने में 10 से माइनस चार ।प्लेट 10 से नमूनों के १०० माइक्रोलीटर, इनपुट 10 से माइनस आठ, इनपुट 10 से माइनस 10, आउटपुट 10 से माइनस दो, आउटपुट 10 से माइनस थ्री, और आउटपुट 10 से माइनस फोर व्यक्तिगत एलबी-एम्पीसिलिन प्लेट्स पर, और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । सुबह स्पष्ट रूप से अलग-अलग कॉलोनियों के साथ प्लेटों पर कॉलोनियों की संख्या गिनें। प्रति 100 माइक्रोलीटर बैक्टीरियल एकाग्रता गिनती प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ कॉलोनी की गिनती गुणा करें।इस प्रोटोकॉल में, बीरा वेरिएंट, बीरा और ईसीपीएक्स-एपी अभिव्यक्ति के बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तित पुस्तकालय के उत्पादन के बाद प्रेरित किया गया था। बैक्टीरिया को आत्मीयता अभिकर्ण के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था, अनबाउंड बैक्टीरिया को छोड़ दिया गया था, और चयनित बैक्टीरिया परिलक्षित किए गए थे । PBAD-BirA-eCPX-एपी व्यक्त बैक्टीरिया के पश्चिमी दाग दोनों प्रेरित और प्रेरित संस्कृतियों में eCPX के आणविक वजन के अनुरूप एक 22 किलोडलटन streptavidin प्रतिक्रिया बैंड का उत्पादन किया ।हालांकि, वे बीरा षोडसी में मौजूद नहीं थे । ईसीपीएक्स-एपी व्यक्त बैक्टीरिया में मजबूत सतह बायोटिनिलेशन ने स्ट्रेप्टाविडिन चुंबकीय मोतियों के अलावा और ट्यूब के तल पर एक गोली के गठन पर एकत्रीकरण का कारण बना, जिसे एलाइन उत्परिवर्तन अभिव्यक्ति बैक्टीरिया के लिए lysine के साथ eCPX के साथ नहीं देखा गया था। स्ट्रेप्टाविडिन पुलडाउन से होने वाले वर्षा के विश्लेषण में ईसीपीएक्स-एपी संस्कृतियों से नमूनों में एक स्पष्ट 22-किलोडलटन स्ट्रेप्टाविडिन-प्रतिक्रिया और एंटी-हेक्साहिस्टिडीन बैंड प्रदर्शित किया गया, लेकिन एलाइन म्यूटेशन संस्कृतियों के साथ eCPX-AP नहीं।इसी तरह, स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों से बंधे बैक्टीरिया की गिनती eCPX-एपी में काफी अधिक थी, जो eCPX-AP lysine से alanine उत्परिवर्तन संस्कृतियों के लिए । सबसे महत्वपूर्ण कदम स्ट्रेप्टाविडिन-बाउंड बैक्टीरिया की सख्त धुलाई है। एक कठोर धोने से आश्वस्त होता है कि सतह-प्रदर्शित बायोटिन वाले केवल बैक्टीरिया का चयन किया जाता है।एक बार बैक्टीरिया का स्पष्ट संवर्धन देखा जाता है, तो अलग क्लोन को और अधिक उत्परिवर्तित किया जा सकता है और इस तरह अत्यधिक सक्रिय बीरा वेरिएंट विकसित हो सकते हैं जो देशी प्रोटीन के विशिष्ट बायोटिनाइलेशन की अनुमति देते हैं।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

श्रेणी बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच के लिए &#39;bioluminescent&#39; रिपोर्टर फेज

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

का चयन प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emमानव मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं> Cytoadhesion के लिए परजीवियों

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

बैक्टीरियल आसंजन के अध्ययन में कतरें तनाव का परिचय

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

निर्देशित थर्मास्टाइबल जीवाणुलयनी एंजाइमों के विकास के लिए एक नई स्क्रीनिंग पद्धति

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालयों से स्केलेबल उच्च Throughput चुनाव

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon म्यूटेंट

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

विकास और मानव न्युट्रोफिल व्युत्पन्न विशालकाय phagocytes के एक उपन्यास उप-जनसंख्या की पहचान<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...