Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
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著者らは、専門家の技術者の支援のためにモハメド・アブドゥラヒ・アーメドに感謝します。この研究は、ルンドベック財団、ノボ・ノルディスク財団、デンマーク腎臓協会、Aase og Ejnarダニエルセン財団、A.P.モラー医学振興財団、クヌードとエディス・エリクセンからの助成金によって支援されました。記念財団

1. pBAD BirA-eCPX-APにおけるペプチド符号化シーケンシング配列の挿入
注:天然標的タンパク質を生体化するBirA変異体を選択するには、少なくとも1つのリジン(K)残剤を含むタンパク質一次配列中の15-アミノ酸ペプチド配列を同定することから始める。
<ol><li>シーケンス操作スイート12に移動します。</li>
	<li>FASTA形式で入力ボックスに特定され?...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

すべての選択方法に関しては、洗浄ステップのストリンジェンシーが最も重要です。選択したクローンの増幅前にビーズから細菌を照合する必要がないため、以前にファージディスプレイシステムで行われたように、ビオチンとストレプトアビジンの間の高い親和性結合を使用することができます。BirAバリアント7、8の選択。これにより、希少な?...

タンパク質のバイオチリン化は、その親和性の単離および検出のための強力なタグを作成します。酵素タンパク質バイオチニル化は、ビオチンタンパク質リチウムによって触媒された非常に特異的な翻訳後修飾である。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAは、非常に特異的であり、共有的に特定のリジン残剤1で天然に存在するタンパク質の制限された数のみを共有生物化する。BirA触媒バイオチニル化の利点は、現在、効果的にビオチン化された小さな合成15-アミノ酸ビオチンアクセプテイタペプチド(AP)と標的タンパク質を融合することによって利用され、非常に特異的であり、Via3,4,5の共発現または添加による生体内およびインビトロバイオチニル化の効率的な。インビボおよびインビトロBirA触媒ビオチンタンパク質ライゲーションは魅力的な標識戦略ですが、その用途はAP融合タンパク質を含むサンプルに限定されています。この方法の目的は、天然の未修飾タンパク質を選択的に生体化し、酵素生物化戦略を使用できるアプリケーションの数を拡大するビオチンタンパク質リチウムの新しい変異体の開発です。
タンパク質機能は、所望の機能を有する遺伝子変異、選択、増幅の反復ラウンドを通じて進化させることができる。強く、有効な選択戦略は、指向性進化のために重要であり、ビオチンタンパク質リガーゼ活性は、ビオチンとストレプトアビジンとそのホモログ6との間の強い結合のために容易に選択される。ファージディスプレイ技術は、バイオチニル化ペプチド7、8を表示するファージの選択を可能にします。しかし、単離されたファージの増幅は細菌宿主の感染を必要とするので、ストレプトアビジンを用いたファージ選択は、非変性下でのビオチンとストレプトアビジンの高親和性結合が事実上不可逆的であるという点でボトルネックを生み出す。条件。ビオチン化ファージの可逆結合を確実にするために、親和性の低いモノメリックアビジンが使用され、その結果、適度〜10倍の濃縮7が得られた。我々は最近、アフィニティマトリックスからの溶出の必要性を排除し、それによって以前のBirA選択システム9からボトルネックを取り除く新しいBirA変異体の単離のための細菌表示方法を開発した。実際、当社の細菌表示システムは、1回の選択ステップ9で活性クローンの>1,000,000倍の濃縮を可能にし、新規のBirA変異体の指向進化のための効果的な選択システムを提供します。
当社の細菌表示システムは、C末端6xHisタグを持つBirAと、標的ペプチドの表面表示を可能にする足場タンパク質の2つの成分で構成されています。ペプチドの有効表示はN-ターミニ10、11の両方で観察することができるので、我々は、円形に透過した外膜タンパク質X(eCPX)を増強足場タンパク質を用いた。標的ペプチド配列をeCPXのC-終位に融合させることで、活性BirA変異体を発現する細菌の生体化が保証される。細菌は、ビオチン化ペプチドが表面に表示されるようになったように効果的なストレプトアビジン選択を可能にする(図1a)。
この方法の目的は、天然タンパク質に存在するペプチド配列をビオチン化するBirAの新規変異体を選択することです。このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-AP上に存在する遺伝子によってコードされ、これは、アビノセ誘導性プロモーターを含むBirA(araBAD)、およびeCPX9を制御するT7プロモーター(図1b)を含む。本プロトコルは、1)標的タンパク質由来のペプチドをeCPXのC末端に組み込む場合の詳細な手順、2)エラーが起こりやすいPCRによるBirAの変異ライブラリーの作成、3)ストレプトアビジン結合細菌の選択について説明する。磁気活性化細胞選別(MACS)、4)細菌濃縮の定量化、および5)単離クローンの初期特性特性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

ビオチンは、タンパク質の単離と検出のための強力なタグを提供するタンパク質の魅力的な翻訳後修飾です。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAによる酵素生物化は非常に特異的であり、そのネイティブ環境における標的タンパク質の生体化を可能にする。しかしながら、BirA媒介バイオチリン化の現在の使用法は、標的タンパク質中の合成アクセプターペプチド(AP)の存在を必要とする。したがって、その用途は、APを含むするように設計されたタンパク質に限定される。本プロトコルの目的は、未修飾標的タンパク質に由来するペプチドの細菌表示を用い、ペプチドを生体化するBirA変異体を選択することである。システムは細菌表面のペプチド表示のための足場と共にBirA変異体の共発現を可能にする単一のプラスミドに基づいている。このプロトコルは、ターゲットペプチドをディスプレイ足場に組み込む場合の詳細な手順、BirAライブラリの作成、アクティブなBirA変異体の選択、および単離されたBirA変異体の初期特性を説明する。この方法は、複雑な溶液中で天然タンパク質を生体化するビオチンタンパク質リチウムのさらなる方向進化に使用できる新規BirA変異体の単離に対して非常に効果的な選択システムを提供する。

pBAD-BirA-eCPX-AP発現細菌のウェスタンブロットは、eCPXの分子量と一致する〜22 kDa連鎖性連鎖反応バンドを産生する(図2a)。BirA-6xHisとは異なり、生体化eCPX-APは、未誘導培養および誘導培養培養(図2a)の両方に存在し、未誘導培養および内因性BirAによるAPのその後のバイオチリン化においても、T7プロモーター活性が小さいためで...

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Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

このプロトコルは、ネイティブタンパク質の特異的ビオチン化を可能にするBirAの新しい変異体を単離するための非常に効果的な細菌ディスプレイシステムを提供する。この技術の主な利点は、高親和性ストレプトアビジン選択を使用してBirA変異体を選択することです。これにより、非アクティブなクローンが確実に削除され、高効率な選択プロセスが作成されます。まず、プラスミドエディタで、ペプチドコード配列の逆補体の最後の30ヌクレオチドを含むようにフォワードプライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列をその5素端に加える。ペプチドコード配列の逆補体の最初の30ヌクレオチドを含むようにリバースプライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列をその5素端に加える。次に、20マイクロリットルPCR反応をセットアップし、薄壁PCRチューブに試薬を加えます。チューブをサーマルサイクラーに移し、原稿に従ってPCRを行います。次に、1%アガロースゲルに対して5マイクロリットルのPCR反応を実行し、6キロベースPCR産物の増幅を確認し、原稿に従って進めます。さて、変異型メガプライマーをビラヘキサヒスチジン前方および逆プライマーで合成し、PCRチューブに、調製した標的ペプチド配列をテンプレートとしてpBAD-BirA-eCPXのナノグラム1個を添加する。メーカーの指示に従って、60°Cのアニーリング温度で35のPCRサイクルを設定します。次に、1%アガロースゲルで5マイクロリットルの増幅反応を実行し、984塩基対PCR産物の増幅を確認します。市販のPCR精製キットを用いて残りの45マイクロリットルの増幅反応からPCR産物を精製し、分光光度計を使用してDNA収率を定量化します。薄壁PCRチューブに、調製した変異型メガプライマーに試薬を加えて、サンプル反応を調製する。反応混合物をサーマルサイクラーに移し、原稿に従ってPCRを実行する。増幅反応を摂氏4度または氷の上に保存します。次に、Dpn1制限酵素の1マイクロリットルを増幅反応に直接加え、穏やかに混ぜます。反応混合物をスピンダウンし、摂氏37度で2時間インキュベートする。2時間後、Dpn1反応の2マイクロリットルを持つチューブ内のT7 Express lysY/Iqの有能な大腸菌細胞を変換します。まず、1%グルコースを含むLBの100ミリリットルと1ミリリットルのビラライブラリーを用いたアンピシリン1ミリグラムを接種し、200rpmで振ると摂氏37度で一晩インキュベートする。次いで、1%グルコースを含むLBの5ミリリットルを接種し、1ミリリットルのアンピシリン1ミリグラムを100マイクログラムの一晩培養した。2時間30分、または培養液が約0.5のOD600に達するまでインキュベートする。次に、L-アラビノース、100マイクロモルIPTG、および100マイクロモルビオチンによって0.2%重量でeCPXおよびBirA発現を誘導する。200 rpmで37°Cで1時間、文化を振ります。培養物を5,000回gで10分間遠心し、上清を除去する。氷冷PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、遠心分離機を5,000倍gで5分間再懸濁する。上清を捨て、400マイクロリットルの氷冷PBSで細胞を再懸濁し、細胞を氷の上に保存する。次いで、再懸濁セルの10マイクロリットルを、標識された1.5ミリリットルのチューブに入れて入力します。氷の上に保管してください。次に、20マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを1ミリリットルの氷冷PBSでチューブで洗浄し、ベンチトップの磁性粒子分離器にチューブを2分間入れ、上清を慎重に取り除きます。20マイクロリットルの氷冷PBS中のストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁し、ビーズ溶液を以前に調製した390マイクロリットルの再懸濁細胞に移す。軽くピペットで混ぜます。その後、摂氏4度で30分間インキュベートします。磁性粒子分離器に強磁球を持つ柱を置き、5ミリリットルの氷冷PBSで洗浄します。細胞およびストレプトアビジン磁気ビーズをチューブからセパレータに取り付けられたカラムに移します。カラムリザーバーが空になったら、毎回500マイクロリットルで氷冷PBSの総体積5ミリリットルでカラムを洗います。その後、セパレータからカラムを取り出し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。氷冷PBSのピペットを1ミリリットルのカラムに入れ、プランジャーを使用して磁気標識された細胞を溶出させる。その後、1.5ミリリットルのチューブをベンチトップセパレーターに入れ、磁気標識されたセルを1ミリリットルの氷冷PBSで洗浄します。氷冷PBSの1ミリリットルで磁気標識された細胞を穏やかに再懸濁する。再懸濁液の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに転写して出力します。磁気標識された細胞を用いて1%グルコースと1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含むLBの100ミリリットルを接種し、200rpmで振ると摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、LBの一晩培養物の10ミリリットルをグリセロールとグリセロールの最終濃度15%に組み合わせ、マイナス80度で保存して冷凍庫の在庫を作ります。次の選択のラウンドのために一晩培養の100マイクロリットルを使用してください。次に、990マイクロリットルの氷冷PBSを入力サンプルと出力サンプルの両方に加え、チューブ入力10をマイナス2にラベル付けし、出力10をマイナス2にそれぞれラベルを付けます。入力サンプルでマイナス10に10の最終的な希釈に達するまで氷冷PBSで2つのサンプルの10倍の連続希釈を行い、出力サンプルではマイナス4に10倍に達します。入力10からマイナス6までのサンプルのプレート100マイクロリットル、入力10からマイナス8、マイナス10への入力10、マイナス2への出力10、マイナス3への出力10、個々のLBアンピシリンプレート上のマイナス4に10を出力し、摂氏37度で一晩インキュベートする。朝、明確に分離されたコロニーを持つプレート上のコロニーの数を数えます。コロニー数と希釈係数を掛け合わせ、100マイクロリットル当たりの細菌濃度カウントを求めます。このプロトコルでは、BirAバリアントのランダムに変異したライブラリの生成後、BirAおよびeCPX-AP発現が誘導された。細菌を親和性試薬でインキュベートし、非結合菌を廃棄し、選択した細菌を増幅した。pBAD-BirA-eCPX-AP発現細菌のウェスタンブロットは、誘導性および誘導培養の両方においてeCPXの分子量と一致する22キロダルトンストレプトアビジン反応バンドを産生した。しかし、彼らはビラヘキジジンには存在しなかった。eCPX-AP発現細菌における強い表面ビオチン化は、ストレプトアビジン磁気ビーズの添加とチューブの底部のペレットの形成に凝集を引き起こし、これはアラニン突然変異発現細菌にリジンを有するeCPXでは観察されなかった。ストレプトアビジンプルダウンからの沈殿物の分析は、eCPX-AP培養物からのサンプル中に22キロダルトンストレプトアビジン反応および抗ヘキサヒスチジンバンドを明らかにしたが、リジンからアラニン突然変異培養物へのeCPX-APは示さなかった。同様に、ストレプトアビジンビーズに結合した細菌の数は、アラニン突然変異培養に対するeCPX-APリジンよりもeCPX-APにおいて有意に高かった。最も重要なステップはストレプトアビジン結合細菌の厳格な洗浄である。厳格な洗浄は、表面表示ビオチンを有する細菌のみが選択されることを保証する。細菌の明確な濃縮が観察されると、単離されたクローンをさらに変異させ、それによって天然タンパク質の特異的なビオチン化を可能にする非常に活性なBirA変異体を開発することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

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耐熱性溶菌酵素の定向進化のための新しいスクリーニング法

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

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Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

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発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...