Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
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저자는 전문 기술자 지원에 대한 모하메드 압둘라흐리 아메드 감사. 이 작품은 룬드벡 재단, 노보 노디스크 재단, 덴마크 신장 협회, 아세 og Ejnar 다니엘센 재단, 의학 발전을위한 A.P. Møller 재단, 그리고 크누드와 에디스 에릭센의 보조금에 의해 지원되었다 기념 재단.

1. pBAD BirA-eCPX-AP에 펩타이드 코딩 시퀀스 삽입
참고: 네이티브 표적 단백질을 바이오티니레이팅하는 BirA 변이체를 선택하려면, 적어도 하나의 라이신(K) 잔기를 함유하는 단백질 1차 서열에서 15아미노산 펩티드 서열을 식별하는 것으로 시작한다.
<ol><li>시퀀스 조작 제품군12로이동합니다.</li>
	<li>확인된 15개의 아미노산 펩타이드 서열을 FASTA 형?...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

모든 선택 방법에 관해서는, 세척 단계의 엄격성이 가장 중요합니다. 박테리아는 선택된 클론의 증폭 전에 구슬에서 용출될 필요가 없기 때문에, 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 높은 친화도 결합은 이전에 파지 디스플레이 시스템과 마찬가지로 낮은 친화도 아비딘을 사용하는 대신 사용될 수 있습니다. BirA 변종7,8의선택 . 이것은 희귀 한 클론이 선택?...

단백질의 생체 화는 친화성 격리 및 검출을위한 강력한 태그를 만듭니다. 효소 단백질 생물항화는 비오틴 단백질 리가제에 의해 촉매작용된 고도로 특이적인 번역 후 변형이다. 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA는 매우 특이적이고 공유성 바이오티니레이트는 특정 리신 잔기에서 자연적으로 발생하는 단백질의 제한된 수에불과합니다 1. BirA 촉매 생물항화의 장점은 현재 표적 단백질을 작은 합성 15-아미노산 비오틴 수용기 펩타이드(AP)와 융합하여 효과적으로 생체티니레이팅2를 허용하고, 고도로 특이적이고 비라3,4,5의공동 발현 또는 첨가에 의한 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생물학적 인 효율적. 생체 내 및 시험관 내 BirA 촉매 비오틴 단백질 결찰은 매력적인 라벨링 전략이지만, 그 적용은 AP 융합 단백질을 포함하는 샘플로 제한된다. 이 방법의 목적은 선택적으로 네이티브 변형되지 않은 단백질을 생물항화하는 비오틴 단백질 리가제의 새로운 돌연변이체의 개발이며, 이에 따라 효소 생물항화 전략이 사용될 수 있는 응용 분야의 수를 확장합니다.
단백질 기능은 원하는 기능을 가진 유전자 변이체의 반복적인 라운드를 통해 진화될 수 있고, 유전자 변이체의 선택, 증폭. 강력하고 효율적인 선택 전략은 비오틴과 스트렙타비딘 및 그 호몰로그(homologs6)사이의 강한 결합으로 인해 지시된 진화 및 비오틴 단백질 리가제 활성이 용이하게 선택되기 위해 매우 중요하다. 파지 디스플레이 기술은 생체 연화 펩티드7,8을표시하는 파지의 선택을 허용한다. 단신 파지의 증폭은 세균 성 숙주의 감염을 필요로하기 때문에, 그러나, streptavidin를 가진 파지 선택은 streptavidin에 비오틴의 높은 친화도 결합이 비 이변의 밑에 사실상 돌이킬 수 없다는 점에서 병목 현상을 만듭니다 조건. 생체 면역 파지의 가역적 결합을 보장하기 위해, 낮은 친화력을 가진 단조로운 아비딘을 사용하였고, 그 결과 ~ 10 배 농축7. 우리는 최근에 선호도 매트릭스로부터 용출의 필요성을 제거하고 이에 따라 이전 BirA 선택 시스템9에서병목 현상을 제거하는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 세균 표시 방법을 개발하였다. 실제로, 우리의 세균 디스플레이 시스템은 단일 선택 단계9에서활성 클론의 >1,000,000 배 농축을 허용하므로 새로운 BirA 변종의 지시 된 진화를위한 효과적인 선택 시스템을 제공합니다.
우리의 세균 성 디스플레이 시스템은 두 가지 구성 요소로 구성, C 말단 6xHis 태그와 비계 단백질은 대상 펩티드의 표면 표시를 허용. 우리는 펩타이드의 효과적인 디스플레이가 N-및 C-테르미니10,11모두에서 관찰될 수 있기 때문에 스캐폴드 단백질강화된 원형 변막 단백질 X(eCPX)를 사용하였다. 표적 펩타이드 서열을 eCPX의 C-종점과 융합하면 활성 BirA 변이체를 발현하는 박테리아의 생체이식이 보장된다. 박테리아는 생체 연화 된 펩티드가 이제 표면에 표시됨에 따라 효과적인 스트렙타비딘 선택을 허용합니다(도 1a).
이 방법의 목적은 네이티브 단백질에 존재하는 펩티드 서열을 바이오티엔테인화하는 BirA의 새로운 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 플라스미드 pBAD-BirA-eCPX-AP에 존재하는 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 비라(araBAD)를 제어하는 아라비노스 유도 프로모터와 eCPX9를 제어하는 T7 프로모터를 함유한다(도1b). 본 프로토콜은 1) 표적 단백질에서 유래된 펩타이드를 eCPX의 C 말단에 혼입시키는 것에 대한 상세한 절차를 설명하고, 2) 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의한 BirA의 돌연변이 라이브러리생성, 3) 스트렙타비딘 결합 박테리아의 선택에 의해 자기 활성화 세포 선별 (MACS), 4) 박테리아 농축의 정량화 및 5) 분리 된 클론의 초기 특성.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

비오틴은 단백질의 분리 및 검출을 위한 강력한 태그를 제공하는 단백질의 매력적인 번역 후 변형입니다. 대장균 바이오틴 단백질 리가제 BirA에 의한 효소 생물학적 인화는 매우 특이적이며 그들의 모국 환경에서 표적 단백질의 생체 이식을 허용합니다. 그러나, 현재 BirA 매개 생물항화의 사용은 표적 단백질에 합성 수용기 펩티드(AP)의 존재를 요구한다. 따라서, 그 적용은 AP를 포함하도록 설계된 단백질로 제한된다. 본 프로토콜의 목적은 수정되지 않은 표적 단백질로부터 유래된 펩타이드의 세균 디스플레이를 사용하여 펩티드를 바이오티엔화하는 BirA 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 세균 표면에 펩티드 디스플레이를 위한 스캐폴드와 함께 BirA 변이체의 공동 발현을 허용하는 단일 플라스미드를 기반으로 한다. 프로토콜은 디스플레이 스캐폴드 내로 표적 펩티드의 혼입, BirA 라이브러리의 생성, 활성 BirA 변이체의 선택 및 단리된 BirA 변이체의 초기 특성화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 이 방법은 복잡한 용액에서 기본 단백질을 바이오티엔화하는 비오틴 단백질 리가제의 추가 적인 진화에 사용될 수 있는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 매우 효과적인 선택 시스템을 제공한다.

pBAD-BirA-eCPX-AP 발현 박테리아의 서쪽 얼룩은 eCPX의 분자량과 일치하는 ~22 kDa 스트렙타비딘 반응 밴드를 생성한다(도2a). BirA-6xHis와는 달리, 생체티닐화된 eCPX-AP는 유도되지 않은 배양물 및 유도된 배양물 모두에서 존재하였다(도2a)내인성 비라에 의한 AP의 유도되지 않은 배양 및 후속 생물항화에서도 T7 프로모터 활성의 작은 정?...

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Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

이 프로토콜은 네이티브 단백질의 특정 생체 자극을 허용하는 BirA의 새로운 변이체를 격리하기 위한 매우 효과적인 세균 디스플레이 시스템을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 친화성 스트렙타비딘 선택을 사용하여 BirA 변형을 선택한다는 것입니다. 이렇게 하면 비활성 복제본이 제거되므로 매우 효율적인 선택 프로세스가 생성됩니다.시작하려면, 플라스미드 편집기에서, 펩티드 코딩 서열의 역보체의 마지막 30뉴클레오티드를 포함하는 전방 프라이머를 설계하고, 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열을 5-프라임 엔드에 첨가한다. 역프라이머를 설계하여 펩티드 코딩 서열의 역보체의 제30뉴클레오티드를 포함하고, 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열을 5-프라임 엔드에 첨가한다. 그런 다음 20 마이크로리터 PCR 반응을 설정하려면 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 시약을 추가합니다.튜브를 열 사이클러로 옮기고 원고에 따라 PCR을 수행합니다. 다음으로, PCR 반응의 5마이크로리터를 1%아가로즈 젤에 실행하여 6킬로베이스 PCR 제품의 증폭을 확인하고 원고에 따라 진행한다. 이제, 돌연변이 메가프라이머를 BirA hexahistidine 앞뒤로 프라이머로 합성하기 위해 PCR 튜브에서 준비된 표적 펩티드 서열과 함께 pBAD-BirA-eCPX의 나노그램 1나노그램을 템플릿으로 추가한다.제조 업체의 지시에 따라 60 섭씨 60도의 온도와 35 PCR 사이클을 설정합니다. 이어서, 984염염쌍 PCR 제품의 증폭을 검증하기 위해 1%아가로즈 젤상증폭 반응의 5개의 마이크로리터를 실행한다. 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭 반응의 나머지 45 마이크로리터로부터 PCR 제품을 정화하고, 광측계를 사용하여 DNA 수율을 양화한다.얇은 벽PCR 튜브에서, 샘플 반응을 준비하기 위해 준비된 돌연변이 메가 프라이머에 시약을 추가합니다. 반응 혼합물을 열 사이클러로 옮기고 원고에 따라 PCR을 실행합니다. 증폭 반응을 섭씨 4도 또는 얼음에 저장합니다.다음으로, 증폭 반응에 Dpn1 제한 효소의 마이크로리터 1개를 직접 넣고 부드럽게 섞습니다. 반응 혼합물을 스핀 다운하고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 2 시간 후, Dpn1 반응의 두 마이크로 리터와 튜브에서 T7 익스프레스 lysY / Iq 유능한 E.coli 세포를 변환합니다.첫째, 비르A 도서관의 1 밀리리터와 암피실린 밀리리터 당 1%의 포도당 100 마이크로그램을 함유하고, 200 rpm에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하는 LB의 100 밀리리터를 접종합니다. 그런 다음, 하룻밤 문화의 100 마이크로 리터와 암피실린의 밀리리터 당 1 %의 포도당 100 마이크로 그램을 포함하는 LB의 5 밀리리터를 접종. 2시간 30분 동안 또는 문화가 약 0.5의 OD600에 도달할 때까지 배양합니다.다음으로, 부피 L-아라비노스, 100 마이크로몰라 IPTG 및 100 마이크로몰러 비오틴에 의해 0.2%의 중량으로 eCPX 및 BirA 발현을 유도한다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 200rpm에서 문화를 흔들어 보시고 있습니다. 5, 000배g에서 10분간 원심분리하고 상체를 제거합니다.얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 원심분리기는 5분, 000배 g에서 5분간 반복합니다. 상체를 버리고, 얼음 차가운 PBS의 400 마이크로 리터에 세포를 다시 중단하고, 얼음에 세포를 저장합니다. 그런 다음, 재중단된 세포의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 전달하여 입력을 표시하였다.얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 20 마이크로리터의 스티르프타비딘 마그네틱 비즈를 튜브에 얼음-차가운 PBS 1밀리리터로 세척하고, 튜브를 벤치탑 자기 입자 분리기에 2분 동안 배치하고, 상판을 조심스럽게 제거한다. 얼음 차가운 PBS의 20 마이크로 리터에서 스트렙타비딘 자기 구슬을 다시 중단하고, 비드 용액을 이전 390 마이크로리터로 재일시 중단된 세포로 이송한다.부드럽게 파이펫팅으로 섞는다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양하십시오. 강자성 구가 있는 컬럼을 자기 입자 분리기에 놓고 얼음차가운 PBS 5밀리리터로 세척합니다.세포와 연쇄상 구슬을 튜브에서 분리기에 부착된 컬럼으로 옮기다. 기둥 저장소가 비어 있으면 매번 500 마이크로리터에서 총 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 컬럼을 세척하십시오. 그 후, 분리기에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.파이펫은 얼음차가운 PBS의 1밀리리터를 기둥에 얹고 플런저를 사용하여 자기 라벨이 부착된 세포를 엘로우시합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브를 벤치탑 분리기에 넣고 자기 라벨이 부착된 셀을 얼음차가운 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 얼음차가운 PBS의 1밀리리터에서 자기 라벨이 부착된 세포를 부드럽게 재연합니다.1.5 밀리리터 튜브 라벨 출력으로 리서스펜션의 10 마이크로리터를 전송합니다. 100 밀리리터의 LB는 자기 라벨이 부착된 세포와 함께 밀리리터 암피실린 당 1%의 포도당 100 마이크로그램을 함유하고, 200rpm에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 결합 10 글리세롤과 LB에서 하룻밤 문화의 밀리리터를 결합 15%의 최종 농도에 섭씨 영하 80도 냉동고 주식을 만들기 위해 섭씨.다음 선발을 위해 100 마이크로리터의 야간 문화를 사용하십시오. 이제 입력 및 출력 샘플에 990 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 추가하고 튜브 입력 10을 마이너스 2로 표시하고 각각 마이너스 2에 10을 출력합니다. 10~10의 최종 희석이 입력 샘플에서 10~10에 도달할 때까지 얼음-차가운 PBS에서 두 샘플의 10배 연속 희석을 하고, 출력 샘플에서 10~4개의 마이너스 4에 도달한다.100 마이크로리터의 샘플 100 마이크로리터는 입력 10에서 영하 6도까지, 입력 10에서 영하 8개, 입력 10에서 영하 10, 영하 10대 2, 출력 10에서 영하 3개, 출력 10~영하 4도, 그리고 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 아침에, 명확하게 분리 된 식민지와 접시에 식민지의 수를 계산합니다. 100 마이크로리터 당 세균 농도 수를 얻기 위해 희석 계수와 콜로니 카운트를 곱한다.이 프로토콜에서, BirA 변종의 임의로 돌연변이된 라이브러리의 생성 후, BirA 및 eCPX-AP 발현이 유도되었다. 박테리아는 친화성 시약으로 배양되었고, 바운드되지 않은 박테리아는 버려졌고, 선택된 박테리아가 증폭되었다. pBAD-BirA-eCPX-AP 발현 균의 서쪽 얼룩은 유도되지 않은 유도된 배양모두에서 eCPX의 분자량과 일치하는 22킬로달톤 스트렙타비딘 반응 밴드를 생산하였다.그러나, 그들은 BirA 헥사히스티딘에 존재하지 않았다. eCPX-AP 발현 박테리아의 강한 표면 생체자극은 스테렙타비딘 자기 구슬을 첨가하고 튜브 의 바닥에 펠릿의 형성을 추가하면 응집을 일으켰으며, 이는 알란 돌연변이 발현 박테리아에 리신을 가진 eCPX로 관찰되지 않았다. 스트렙타비딘 풀다운으로부터침을 분석한 결과, eCPX-AP 배양물에서 시료에 명확한 22킬로달톤 스트렙타비딘 반응 및 항 헥사히스티딘 밴드를 표시했지만, 리신을 가진 eCPX-AP는 알란 돌연변이 배양에 대한 리신이 없었다.유사하게, 스트렙타비딘 비드에 묶인 박테리아의 수는 eCPX-AP에서 알라닌 돌연변이 배양에 대한 eCPX-AP 리신보다 상당히 높았다. 가장 중요한 단계는 연쇄상 구균 바운드 박테리아의 엄격한 세척입니다. 엄격한 세척은 표면이 표시된 비오틴이 있는 박테리아만 선택되도록 보장합니다.일단 박테리아의 명확한 농축이 관찰되면, 고립 된 클론은 더 돌연변이 될 수 있으며, 따라서 네이티브 단백질의 특정 생체 자극을 허용하는 고도로 활성 BirA 변종을 개발할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

연구

면역학 및 감염병학

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...