Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
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Os autores agradecem a Mohamed Almeida Ahmed pela assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fundação Lundbeck, da Fundação Novo Nordisk, da Associação Dinamarquesa de rins, da Fundação Aase og Ejnar Danielsen, da Fundação A.P. Møller para o avanço da ciência médica, e Knud e Edith Eriksen Fundação Memorial.

1. inserção da seqüência de sequenciamento de peptídeos em pBAD BirA-eCPX-AP
Nota: Para selecionar para variantes BirA que biotinylate uma proteína alvo nativa, começar por identificar uma seqüência de peptídeo de 15 aminoácidos na seqüência primária de proteínas que contém pelo menos um resíduo de lisina (K).
<ol><li>Vá para a suíte de manipulação de sequências12.</li>
	<li>Cole a seqüência de peptídeo identificado 15 aminoá...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Quanto a todos os métodos de seleção, a rigor dos passos de lavagem é de extrema importância. Uma vez que as bactérias não precisam ser eluidas dos grânulos antes da amplificação dos clones selecionados, a ligação de alta afinidade entre a biotina e a streptavidina pode ser usada em vez de usar avidinas de menor afinidade, como anteriormente feito com o sistema de exibição de fago, para a seleção das variantes do Bira7,8. Isto assegura-se de que o...

A biotinilação de uma proteína cria uma etiqueta poderosa para seu isolamento e detecção de afinidade. A biotinilação de proteínas enzimáticas é uma modificação pós-translacional altamente específica catalisada por ligases de biotina-proteína. A ligase de proteína de E. coli Bira é extremamente específica e covalentemente biotinylates apenas um número restrito de proteínas que ocorrem naturalmente em resíduos específicos de lisina1. As vantagens da biotinilação catalisada pelo BirA são atualmente aproveitadas pela fusão da proteína-alvo com um pequeno peptídeo aceitador de biotina de 15 aminoácidos sintéticos (AP) que é efetivamente biotinilado2 e permite o altamente específico e biotinilação in vivo e in vitro eficiente por coexpressão ou adição de Bira3,4,5. Embora a ligadura de biotina-proteína catalisada in vivo e in vitro seja uma estratégia de rotulagem atrativa, sua aplicação é limitada a amostras que contenham proteínas fundidas por AP. O objetivo deste método é o desenvolvimento de novos mutantes de ligases de biotina-proteína que seletivamente biotinylate proteínas nativas não modificadas e, assim, ampliar o número de aplicações em que a estratégia de biotinilação enzimática pode ser usada.
A função protéica pode ser evoluída através de rodadas iterativas da mutação genética, seleção e amplificação de variantes genéticas com a função desejada. Uma estratégia de seleção forte e eficiente é crucial para a evolução dirigida e a atividade da ligase da biotina-proteína é prontamente selecionada devido à forte ligação entre a biotina e a streptavidina e seus homólogos6. As tecnologias de display phage permitem a seleção de fagos que exibem peptídeos biotinilados7,8. Desde que a amplificação de fagos isolados exige a infecção de um anfitrião bacteriano, entretanto, a seleção do fago com estreptavidina cria um gargalo que a ligação da elevado-afinidade da biotina ao estreptavidina é virtualmente irreversível não-desnaturando Condições. Para assegurar a ligação reversível de phages biotinylated, os avidins monoméricas com mais baixa afinidade foram usados que conduziram a um enriquecimento modesto de ~ 10 vezes7. Nós desenvolvemos recentemente um método bacteriano da exposição para o isolamento de variantes novas de BirA que elimina a necessidade para a eluição da matriz da afinidade e remove desse modo um gargalo dos sistemas precedentes da seleção de BirA9. Na verdade, nosso sistema de exibição bacteriana permite um enriquecimento de > 1, 000, 000 vezes de clones ativos em uma única etapa de seleção9, proporcionando assim um sistema de seleção eficaz para a evolução dirigida de novas variantes Bira.
Nosso sistema bacteriano da exposição consiste em dois componentes, BirA com um Tag do C-terminal 6xHis e uma proteína do andaime que permita a exposição de superfície de um peptide do alvo. Utilizou-se a proteína de membrana externa reforçada circularmente permutada de proteínas de andaime X (eCPX), uma vez que a exposição efetiva de peptídeos pode ser observada tanto no N-e C-Termini10,11. A fusão da sequência peptídica alvo para o C-Terminus de eCPX assegura a biotinilação de bactérias expressando variantes de BirA ativas. As bactérias permitem a seleção efetiva de streptavidina como o peptídeo biotinilado agora é exibido na superfície (Figura 1a).
A finalidade deste método é selecionar para variantes novas de BirA que as seqüências do peptide dos biotinylates atuais em proteínas nativas. O sistema é codificado por genes presentes no plasmídeo pBAD-BirA-eCPX-AP, que contém um promotor de arabinose-inducible controlando BirA (araBAD), e um promotor T7 controlando eCPX9 (Figura 1b). O presente protocolo descreve o procedimento detalhado para 1) incorporação de um peptídeo derivado de uma proteína alvo para o C-terminal de eCPX, 2) criação de uma biblioteca mutacional de BirA por PCR propenso a erros, 3) seleção de bactérias ligantes de streptavidina por classificação de células ativadas por magnético (MACS), 4) quantificação do enriquecimento de bactérias e 5) caracterização inicial de clones isolados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

A biotina é uma modificação pós-translacional atraente de proteínas que fornece uma etiqueta poderosa para o isolamento e detecção de proteínas. A biotinilação enzimática pelo e. coli biotina-proteína ligase Bira é altamente específica e permite a biotinilação de proteínas-alvo em seu ambiente nativo; no entanto, o uso atual da biotinilação mediada por BirA requer a presença de um peptídeo aceptor sintético (AP) na proteína alvo. Conseqüentemente, sua aplicação é limitada às proteínas que foram projetadas para conter o AP. O objetivo do presente protocolo é usar a exposição bacteriana de um peptídeo derivado de uma proteína alvo não modificada para selecionar para variantes de BirA que biotinylates o peptídeo. O sistema é baseado em um único plasmídeo que permite a coexpressão de variantes de BirA juntamente com um andaime para o indicador de peptídeo na superfície bacteriana. O protocolo descreve um procedimento detalhado para a incorporação do peptídeo alvo no andaime de exposição, a criação da biblioteca de BirA, a seleção de variações ativas de BirA e a caracterização inicial das variações isoladas de BirA. O método fornece um sistema altamente eficaz da seleção para o isolamento de variantes novas de BirA que podem ser usadas para a evolução dirigida mais adicional de ligases da biotina-proteína que biotinylate uma proteína nativa em soluções complexas.

Western blot de pBAD-BirA-eCPX-AP expressando bactérias produz um ~ 22 kDa streptavidin-reagindo banda consistente com o peso molecular de eCPX (Figura 2a). Ao contrário de Bira-6xhis, o ecpx-AP biotinylated estava atual em culturas não induzidas e induzidas (Figura 2a) devido a um grau pequeno de atividade do promotor T7 mesmo em culturas não induzidas e em biotinilação subseqüente do AP pelo Bira endógeno. No BirA-eCPX...

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Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Aqui nós apresentamos um método para selecionar para variantes novas do ligase BirA da biotina-proteína de E. coli que biotinylates um peptide específico do alvo. O protocolo descreve a construção de um plasmídeo para a exposição bacteriana do peptídeo alvo, geração de uma biblioteca BirA, seleção e caracterização de variantes de BirA.

Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Este protocolo fornece um sistema de exibição bacteriana altamente eficaz para o isolamento de novas variantes de BirA que permite a biotiningação específica de proteínas nativas. A principal vantagem da técnica é que ela seleciona variantes BirA usando a seleção streptavidin de alta afinidade. Isso garante que os clones inativos sejam removidos, criando assim um processo de seleção altamente eficiente.Para começar, em um editor plasmídeo, projete o primer dianteiro para incluir os últimos 30 nucleotídeos do complemento reverso da sequência de codificação de peptídeos, e adicione a sequência de nucleotídeos de ligação plasmida à sua extremidade de cinco primes. Projete o primer reverso para incluir os primeiros 30 nucleotídeos do complemento reverso da sequência de codificação de peptídeos e adicione a sequência de nucleotídeos de ligação plasmida à sua extremidade cinco-prime. Em seguida, para configurar uma reação PCR de 20 microliter, adicione os reagentes em um tubo PCR de paredes finas.Transfira o tubo para um ciclo-de-tempo térmico e execute PCR de acordo com o manuscrito. Em seguida, execute cinco microliters da reação pcr em um gel de 1%agarose para confirmar a amplificação de um produto PCR de seis quilobases, e prossiga de acordo com o manuscrito. Agora, para sintetizar os megaprimers mutantes com hexahistidina bira para a frente e primers invertidos, em um tubo PCR, adicione um nanograma de pBAD-BirA-eCPX com a sequência de peptídeos de destino preparado como um modelo.Configure 35 ciclos de PCR com uma temperatura de 60 graus Celsius de acordo com a instrução do fabricante. Em seguida, execute cinco microliters da reação de amplificação em um gel de 1%agarose para verificar a amplificação de um produto PCR de par de 984 bases. Purifique o produto PCR dos 45 microliters restantes da reação de amplificação usando um kit comercial de purificação pcr, e use um espectógrafo para quantificar o rendimento do DNA.Em um tubo PCR de paredes finas, adicione os reagentes nos megaprimers mutantes preparados para preparar a reação da amostra. Transfira a mistura de reação para um cicloviário térmico e execute o PCR de acordo com o manuscrito. Armazene a reação de amplificação a quatro graus Celsius ou no gelo.Em seguida, adicione um microliter da enzima de restrição Dpn1 diretamente à reação de amplificação e misture suavemente. Gire a mistura de reação e incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Após duas horas, transforme células E.coli competentes T7 Express/Iq em um tubo com dois microliters da reação dpn1.Primeiro, inocular 100 mililitros de LB contendo 1%glicose e 100 microgramas por mililitro de ampicillina com um mililitro da biblioteca BirA, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com tremor a 200 rpm. Em seguida, inocular cinco mililitros de LB contendo 1%de glicose e 100 microgramas por mililitro de ampicillina com 100 microliters da cultura da noite para o dia. Incubar por duas horas e 30 minutos ou até que a cultura atinja um OD600 de aproximadamente 0,5.Em seguida, induzir a expressão eCPX e BirA com 0,2% de peso em volume L-arabinose, 100 micromolar IPTG e biotina de 100 micromolar. Agite a cultura a 200 rpm por uma hora a 37 graus Celsius. Centrifugar a cultura por 10 minutos a 5.000 vezes g, e remover o supernaspe.Resuspend as células em um mililitro de PBS gelado, e centrífuga a 5.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernascer, e resuspenja as células em 400 microliters de PBS gelado, e armazene células no gelo. Em seguida, transfira 10 microliters das células resuspended em uma entrada rotulada de tubo de 1,5 mililitro.Guarde no gelo. Em seguida, lave 20 microliters de contas magnéticas streptavidin em um mililitro de PBS gelado em um tubo, e coloque o tubo em um separador de partículas magnéticas de bancada por dois minutos, e remova cuidadosamente o supernascer. Resuspend as contas magnéticas streptavidin em 20 microliters de PBS gelado, e transfira a solução de contas para os 390 microliters previamente preparados de células resuspended.Misture suavemente a pipetação. Em seguida, incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius. Coloque uma coluna com esferas ferromagnéticas em um separador de partículas magnéticas, e lave com cinco mililitros de PBS gelado.Transfira as células e as contas magnéticas streptavidin do tubo para a coluna anexada no separador. Uma vez que o reservatório da coluna esteja vazio, lave a coluna com um volume total de cinco mililitros de PBS gelado a 500 microliters cada vez. Depois disso, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.Pipeta um mililitro do PBS gelado na coluna, e use o êmbolo para elutar as células magneticamente rotuladas. Em seguida, coloque o tubo de 1,5 mililitro em um separador de bancada, e lave a célula magneticamente rotulada com um mililitro de PBS gelado. Levemente resuspenque as células magneticamente rotuladas em um mililitro do PBS gelado.Transfira 10 microlitres da ressuspensão para uma saída de tubo de 1,5 mililitro. Inocular 100 mililitros de LB contendo 1%glicose e 100 microgramas por ampicillina mililitro com as células magneticamente rotuladas, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia seguinte, combine 10 mililitros da cultura da noite para o dia em LB com glicerol a uma concentração final de 15% e armazene a menos 80 graus Celsius para fazer estoques congeladores.Use 100 microliters da cultura da noite para a próxima rodada de seleção. Agora, adicione 990 microliters de PBS gelados às amostras de entrada e saída, e rotule a entrada dos tubos 10 para os menos dois e saída 10 para o menos dois, respectivamente. Faça diluições seriais de 10 vezes das duas amostras em PBS gelado até que uma diluição final de 10 para o menos 10 seja alcançada na amostra de entrada e 10 a menos quatro na amostra de saída.Placa 100 microliters de amostras de entrada 10 a menos seis, entrada 10 para o menos oito, entrada 10 para menos 10, saída 10 para menos dois, saída 10 para menos três, e saída 10 para menos quatro em placas individuais LB-ampicillin, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Pela manhã, conte o número de colônias nas placas com colônias claramente separadas. Multiplique a contagem da colônia com o fator de diluição para obter a contagem de concentração bacteriana por 100 microliters.Neste protocolo, após a geração de uma biblioteca aleatoriamente mutada de variantes BirA, a expressão BirA e eCPX-AP foi induzida. As bactérias foram incubadas com reagente de afinidade, bactérias não ligadas foram descartadas e bactérias selecionadas foram amplificadas. A mancha ocidental de bactérias expressas pBAD-BirA-eCPX-AP produziu uma banda de reação de streptavidina de 22 quilodalton consistente com o peso molecular do eCPX em culturas não induzidas e induzidas.No entanto, eles não estavam presentes na hexahistidina bira. A forte biotintilação superficial nas bactérias expressas eCPX-AP causou agregação após a adição de contas magnéticas streptavidinas e a formação de uma pelota na parte inferior do tubo, que não foi observada com eCPX com liseina para bactérias de expressão de mutação alanina. A análise do precipitado da pulldown streptavidin mostrou uma faixa clara de 22 kilodalton streptavidin-reacting e anti-hexahistidina nas amostras das culturas eCPX-AP, mas não eCPX-AP com lise para culturas de mutação alanina.Da mesma forma, a contagem de bactérias ligadas às contas de streptavidina foi significativamente maior no eCPX-AP do que a lise eCPX-AP para culturas de mutação alanina. O passo mais importante é uma lavagem rigorosa de bactérias ligadas ao streptavidin. Uma lavagem rigorosa garante que apenas bactérias com biotina exibida pela superfície sejam selecionadas.Uma vez observado um claro enriquecimento de bactérias, os clones isolados podem ser ainda mais mutados e, assim, desenvolver variantes de BirA altamente ativas que permitem a biotiningação específica de proteínas nativas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

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Imunologia e Infecção

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Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

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