Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Авторы благодарят Мохамеда Абдуллахи Ахмеда за помощь специалиста-технического специалиста. Эта работа была поддержана грантами Фонда Лундбека, Фонда Ново Нордиска, Датской ассоциации почек, Фонда Аасе ог. Эйнара Даниэлсена, Фонда А.П. Мюллера по развитию медицинской науки, а также Кнуда и Эдит Эриксен Мемориальный фонд.

1. Вставка пептидкодирования секвенирования последовательности в pBAD BirA-eCPX-AP
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выбрать для BirA варианты, которые биотинилат родной белка цели, начните с определения 15-аминокислоты пептид последовательности в белках первичной последовательности, к?...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Что касается всех методов отбора, строгость стирки шагов имеет первостепенное значение. Так как бактерии не должны быть eluted от бисера до усиления выбранных клонов, высокое сродство связывания между биотином и стрептавидин может быть использован вместо использования нижней сродности ?...

Биотинилация белка создает мощный тег для его изоляции сродства и обнаружения. Биотинилация ферментативного белка является весьма специфической посттрансляционной модификацией, катализированной биотин-белковыми лигазами. E. coli биотин-протеина лигаза BirA является чрезвычайно специфическим и ковалентно биотинилатов только ограниченное количество естественных белков на конкретных остатков лизина1. Преимущества катализированной биотиниляции BirA в настоящее время используются путем сплавления целевого белка с небольшим синтетическим 15-аминокислотным биотином пептида (AP), который эффективно биоинтиниляции2 и позволяет высокоспецифические и эффективное in vivo и in vitro биотинилация путем совместного выражения или добавления BirA3,4,5. Хотя in vivo и in vitro BirA катализируют сяврин-белковую перевязку является привлекательной стратегией маркировки, ее применение ограничено образцами, содержащими слитые AP белки. Целью этого метода является разработка новых мутантов биотин-белковых лигазов, которые избирательно биотинилат местные неизмененные белки и, тем самым, расширяют количество применений, в которых может быть использована ферментативная стратегия биоинжиниляции.
Белковая функция может развиваться с помощью итеративных раундов генной мутации, выделения и усиления вариантов генов с желаемой функцией. Сильная и эффективная стратегия отбора имеет решающее значение для направленной эволюции и биотин-протеиновой лигазной активности легко подобрана из-за сильной связывания между биотином и стрептавидином и его омологами6. Технологии фаги позволяют подбирать фаги, которые отображают биотинилатные пептиды7,8. Поскольку усиление изолированных фагов требует заражения бактериального хозяина, однако, выбор фага стрептавидинсоздает узкое место в том, что высокородность связывания биотина стрептавидин практически необратимым под не-денатурация Условия. Для обеспечения обратимого связывания биотининатированных фагов использовались мономерные алдины с более низким сродством, что привело к скромному обогащениюв10 раз. Недавно мы разработали метод бактериального дисплея для изоляции новых вариантов BirA, который устраняет необходимость в elution из матрицы сродства и тем самым удаляет узкое место из предыдущих систем отбора BirA9. В самом деле, наша бактериальная система отображения позволяет для 1000000 раз обогащение активных клонов в одном шаге отбора9, таким образом, обеспечивая эффективную систему отбора для направленной эволюции романа BirA вариантов.
Наша бактериальная система отображения состоит из двух компонентов, BirA с C-терминал 6xHis тег и эшафот белка, что позволяет для поверхности отображения целевого пептида. Мы использовали эшафот белка расширения круговой пермутированный наружной мембраны белка X (eCPX), так как эффективное отображение пептидов можно наблюдать как на N- и C-терминини10,11. Слияние целевой пептидной последовательности с C-термином eCPX обеспечивает биотинилацию бактерий, выражающих активные варианты BirA. Бактерии позволяют для эффективного выбора стрептавидина, как биотинилаповый пептид теперь отображается на поверхности(Рисунок 1a).
Цель юаней – отобрать для новых вариантов BirA, которые биотинилатируют пептидные последовательности, присутствующие в местных белках. Система кодируется генами, присутствующими на плазмидном pBAD-BirA-eCPX-AP, который содержит арабинос-индуцированный промоутер, контролирующий BirA (araBAD), и промоутер T7, контролирующий eCPX9 (Рисунок 1b). Настоящий протокол описывает детальную процедуру для 1) включения пептида, полученного из целевого белка, в C-терминал eCPX, 2) создание мутационной библиотеки BirA по подверженным ошибкам ПЦР, 3) выбор стрептавидиновых бактерий сортировка клеток с магнитным активированным (MACS), 4) количественная оценка обогащения бактерий и 5) первоначальная характеристика изолированных клонов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Биотин является привлекательной посттрансляционной модификацией белков, которая обеспечивает мощный тег для изоляции и обнаружения белка. Энзиматическая биоинжиниляция e. coli биотина-белка ligase BirA является весьма специфической и позволяет биотинилацию целевых белков в их родной среде; однако, текущее использование BirA опосредоченной биотиниляции требует присутствия синтетического пептида приемного (AP) в целевом белке. Таким образом, его применение ограничивается белками, которые были разработаны, чтобы содержать AP. Цель настоящего протокола заключается в использовании бактериального отображения пептида, полученного из неизмененного белка-мишени, для выбора вариантов BirA, которые биотинилатируют пептид. Система основана на одной плазмиде, которая позволяет совместно выражать варианты BirA вместе с эшафотом для пептидного дисплея на бактериальной поверхности. Протокол описывает детальную процедуру включения целевого пептида в эшафот дисплея, создание библиотеки BirA, выбор активных вариантов BirA и первоначальную характеристику изолированных вариантов BirA. Метод обеспечивает высокоэффективную систему отбора для изоляции новых вариантов BirA, которые могут быть использованы для дальнейшей направленной эволюции биотин-белковых лигазов, которые биотинилат родной белок в сложных растворах.

Западный пятно pBAD-BirA-eCPX-AP, выражающие бактерии, производит стрептавидин-реакционную полосу в соответствии с молекулярным весом eCPX(Рисунок 2a). В отличие от BirA-6xHis, биотинилаповые eCPX-AP присутствовал как в неиндуцированных и индуцированных культур (Рису...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Здесь мы представляем метод, чтобы выбрать для новых вариантов E. coli биотин-протеин лигаза BirA, что биотинилаты конкретной цели пептид. Протокол описывает конструкцию плазмида для бактериального отображения целевого пептида, генерацию библиотеки BirA, выбор и характеристику вариантов BirA.

Бактериальный пептидный дисплей для выбора новых биотинилатирующих ферментов

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Этот протокол обеспечивает высокоэффективную бактериальную систему отображения для изоляции новых вариантов BirA, что позволяет для специфической биотинилации местных белков. Основным преимуществом техники является то, что она выбирает варианты BirA с использованием высокой сродства стрептавидина выбора. Это гарантирует, что неактивные клоны удаляются, создавая тем самым высокоэффективный процесс отбора.Для начала, в плазмидном редакторе, спроектировать перемотку вперед, чтобы включить последние 30 нуклеотидов обратного дополнения пептидной последовательности кодирования, и добавить плазмидную связывающую нуклеотидную последовательность к ее пяти-премьер-концу. Дизайн обратной грунтовки включить первые 30 нуклеотидов обратного дополнения пептида кодирования последовательности, и добавить плазмидной связывающей нуклеотидной последовательности его пять премьер конца. Затем, чтобы настроить 20-микролитровую реакцию ПЦР, добавьте реагенты в тонкостенную трубку ПЦР.Перенесите трубку на тепловой циклер и выполните ПЦР в соответствии с рукописью. Далее запустите пять микролитров реакции ПЦР на геля 1%agarose, чтобы подтвердить усиление шестикилограммового ПЦР-продукта, и продолжайте в соответствии с рукописью. Теперь, чтобы синтезировать мутант megaprimers с BirA гексахистидин вперед и обратной грунтовки, в трубке ПЦР, добавить одну нанограмму pBAD-BirA-eCPX с подготовленной последовательности пептида цели в качестве шаблона.Настройка 35 циклов ПЦР с температурой 60 градусов по Цельсию в соответствии с инструкцией производителя. Затем запустите пять микролитров реакции усиления на 1%agarose гель для проверки усиления 984-базовой пары PCR продукта. Очистите продукт ПЦР от оставшихся 45 микролитров реакции усиления с помощью коммерческого комплекта очистки ПЦР и используйте спектрофотометр для количественной оценки урожайности ДНК.В тонкостенной ПЦР трубки, добавить реагенты в подготовленных мутантов megaprimers подготовить образец реакции. Перенесите реакционной смеси на тепловой циклер, и запустить ПЦР в соответствии с рукописью. Храните реакцию усиления при четырех градусах цельсия или на льду.Затем добавьте один микролитр фермента ограничения Dpn1 непосредственно к реакции усиления и смешайте осторожно. Спин вниз реакционной смеси, и инкубировать в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Через два часа преобразуйте T7 Express lysY/Iq компетентные клетки E.coli в трубку с двумя микролитров реакции Dpn1.Во-первых, привить 100 миллилитров LB, содержащих 1%глюкозу и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина с одним миллилитром библиотеки BirA, и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с тряской при 200 об/мин. Затем прививают пять миллилитров LB, содержащие 1%глюкозу и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина со 100 микролитров ночной культуры. Инкубировать в течение двух часов и 30 минут или до тех пор, пока культура достигает OD600 примерно 0,5.Далее индуцировать eCPX и BirA выражение с 0,2% веса по объему L-арабинозы, 100-микромоляной IPTG, и 100-микромоляр биотин. Встряхните культуру при 200 об/мин в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Центрифуга культуры в течение 10 минут при 5000 раз г, и удалить супернатант.Повторное распределение клеток в один миллилитр ледяной PBS, и центрифуга на 5000 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта, и повторно помесить клетки в 400 микролитров ледяной PBS, и хранить клетки на льду. Затем перенесите 10 микролитров повторно натращенных клеток в 1,5-миллилитровую трубку с маркировкой ввода.Хранить на льду. Далее, мыть 20 микролитров стрептавидина магнитных бусин в один миллилитр ледяной PBS в трубку, и поместить трубку в скамейке магнитной частицы сепаратора в течение двух минут, и тщательно удалить супернатант. Перезаполните стрептавидин магнитными бусинами в 20 микролитров ледяного PBS и перенесите раствор шарика на предыдущие подготовленные 390 микролитров рсуспенных клеток.Смешайте слегка пипетки. Затем инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. Поместите столбец с ферромагнитными сферами в сепаратор магнитных частиц и помойте пятью миллилитров ледяного PBS.Перенесите клетки и стрептавидин магнитные бусины из трубки в колонку, прикрепленную в сепараторе. После того, как столб водохранилища пуст, мыть колонку с общим объемом пять миллилитров ледяной PBS на 500 микролитров каждый раз. После этого снимите столбец с сепаратора и поместите его в 1,5-миллилитровую трубку.Pipette один миллилитр ледяной PBS на колонку, и использовать поршень, чтобы elute магнитно помечены клетки. Затем поместите 1,5-миллилитровую трубку в сепаратор скамейки и вымойте магнитно помеченную клетку одним миллилитром ледяного PBS. Аккуратно повторно почеркните магнитно помеченные клетки в один миллилитр ледяного PBS.Перенесите 10 микролитров повторного незаменимия в 1,5-миллилитровую трубку с маркировкой. Прививка 100 миллилитров LB, содержащих 1%глюкозы и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина с магнитно помечены клетки, и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 200 об/мин. На следующий день, объединить 10 миллилитров ночной культуры в LB с глицеролом до окончательной концентрации 15% и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы морозильник запасов.Используйте 100 микролитров ночной культуры для следующего раунда отбора. Теперь добавьте 990 микролитров ледяного PBS как к входным, так и к выходным образцам, и обозначим вводимые трубы от 10 до минус двух и выход 10 до минус двух, соответственно. Сделайте 10-кратное серийное разбавление двух образцов в ледяном PBS до окончательного разбавления от 10 до минус 10, достигнутого в входной выборке и от 10 до минус четырех в выходной выборке.Плита 100 микролитров образцов от ввода 10 до минус шести, вход 10 до минус восьми, ввод от 10 до минус 10, выход от 10 до минус двух, выход от 10 до минус трех, и выход от 10 до минус четырех на отдельных пластинах LB-ампициллина, и инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию. Утром подсчитывайте количество колоний на плитах с четко разделенными колониями. Умножьте количество колоний с фактором разбавления, чтобы получить количество бактериальной концентрации на 100 микролитров.В этом протоколе, после генерации случайно мутировавших библиотек вариантов BirA, было индуцировано выражение BirA и eCPX-AP. Бактерии были инкубированы с реагентом сродства, несыхваченные бактерии были отброшены, и выбранные бактерии были усилены. Западная помарка pBAD-BirA-eCPX-AP выражая бактерий произвела 22-kilodalton стрептавидин-реагируя полосу в соответствии с молекулярным весом eCPX в обоих индуцированных и индуцированных культурах.Тем не менее, они не присутствовали в BirA гексахистидин. Сильная поверхностная биотинилация в eCPX-AP, выражаюющая бактерии, вызвала агрегацию при добавлении стрептавидина магнитных бусинов и образование гранулы в нижней части трубки, которая не наблюдалась с eCPX с лизином к аланину мутации экспрессии бактерий. Анализ осадка от стрептавидина выдвижной отображается четкий 22-килодальтон стрептавидин-реагирующих и анти-гексахистидин группы в образцах из eCPX-AP культур, но не eCPX-AP с лизином аланина мутации культур.Аналогичным образом, количество бактерий, связанных со стрептавидином бисером, было значительно выше в eCPX-AP, чем лизин eCPX-AP к культурам мутации аланина. Наиболее важным шагом является строгое мытье стрептавидин связанных бактерий. Строгая стирка гарантирует, что выбираются только бактерии с биотином с поверхностным отображением.После того, как наблюдается четкое обогащение бактерий, изолированные клоны могут быть дополнительно мутировали и тем самым развивать высокоактивные варианты BirA, которые позволяют для специфического биотинилирования местных белков.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

&quot;Биолюминесцентный &#39;Reporter Фаг для обнаружения Категория бактериальных патогенов

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Новый метод скрининга для направленной эволюции термостабильных ферментов Бактериолитические

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...