Name: bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Yazarlar uzman teknisyen yardım için Mohamed Abdullahi Ahmed teşekkür ederim. Bu çalışma Lundbeck Vakfı, Novo Nordisk Vakfı, Danimarka Böbrek Derneği, Aase og Ejnar Danielsen Vakfı, A.P. Møller Tıp Biliminin İlerlemesi Vakfı ve Knud ve Edith Eriksen'in bağışları ile desteklendi. Anıt Vakfı.

1. PBAD BirA-eCPX-AP'ye Peptit Kodlama Sıralama Sırasının Eklenmesi
NOT: Yerli bir hedef proteini biyotinylate BirA varyantları için seçmek için, proteinlerbirincil dizi en az bir lizin (K) kalıntısı içeren 15-amino asit peptit dizisi belirleyerek başlar.
<ol><li>Sıralı manipülasyon paketi12gidin.</li>
	<li>Belirlenen 15 amino asit peptid dizisini FASTA formatında giriş kutusuna yapıştırın ve Göndertuşuna bası...

<ol>
	<li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase.">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li><li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme:+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli.">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li><li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li><li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging.">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li><li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase.">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li><li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li><li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme's+Catalytic+Activity+in+vivo.">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li><li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity.">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li><li>Granh&#248;j, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity.">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).</li><li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands.">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li><li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides.">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li><li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+manipulation+suite:+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences.">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li></ol>

Tüm seçim yöntemlerine gelince, yıkama adımlarının sıkılığı son derece önemlidir. Bakterilerin seçilen klonların amplifikasyonönce boncuklardan eluted gerek olmadığından, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek yakınlık bağlayıcı yerine daha düşük afinite avidinler kullanarak kullanılabilir, daha önce faj görüntüleme sistemi ile yapılan, için BirA varyantları seçimi7,8. Bu, nadir klonların seçilmesini ve biyotinylated olma...

Bir proteinin biyotinylation onun yakınlık izolasyon ve algılama için güçlü bir etiket oluşturur. Enzimatik protein biyotinylasyonu, biyotin-protein ligasesleri ile katalize edilen çok spesifik bir post-translational modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA son derece spesifik ve kovalent biyotinylates belirli lizin artıkları sadece sınırlı sayıda doğal olarak oluşan proteinler1. BirA katalize biyotinylasyon avantajları şu anda küçük bir sentetik 15-amino-asit biyotin kabul peptid (AP) ile hedef protein eritilmesi ile harnessedolan etkili biyotinylated 2 ve son derece spesifik ve sağlar bir a3,4,5ile birlikte ekspresyonu veya ilavesi ile in vitro biyotinylasyon verimli. In vivo ve in vitro BirA katalize biotin-protein ligasyonu cazip bir etiketleme stratejisi olmasına rağmen, uygulama AP-erimiş proteinler içeren örnekler ile sınırlıdır. Bu yöntemin amacı, yerli modifiye edilmemiş proteinleri seçici olarak biyotinylate ve böylece enzimatik biyotinylation stratejisinin kullanılabildiği uygulamaların sayısını artıran yeni biyotin-protein ligazlarının geliştirilmesidir.
Protein fonksiyonu gen mutasyonunun yinelemeli turları ile evrilebilir, gen varyantlarının istenilen fonksiyonla seçilmesi ve amplifikasyonu. Güçlü ve verimli bir seçim stratejisi yönlendirilmiş evrim için çok önemlidir ve biotin-protein ligaz aktivitesi biotin ve streptavidin ve homologlar arasındaki güçlü bağlanma nedeniyle kolayca seçilir6. Faj görüntüleme teknolojileri biyotinylated peptidler görüntülemek fajların seçimi için izin7,8. İzole fajların amplifikasyonu bakteriyel konak enfeksiyonu gerektirdiğinden, ancak streptavidin ile faj seçimi, biotinin streptavidin için yüksek afinite bağlama non-denaturing altında hemen hemen geri dönüşümsüz olduğu bir darboğaz oluşturur Koşul -ları. Biyotinylated fajlar geri dönüşümlü bağlanmasını sağlamak için, düşük afinite ile monomerik avidinler mütevazı ~ 10 kat zenginleştirme7sonuçlandı kullanılmıştır. Yakın zamanda yakınlık matrise olan elüsasyon ihtiyacını ortadan kaldıran ve önceki BirA seçim sistemlerinden bir darboğaz çıkaran yeni BirA varyantlarının izolasyonu için bakteriyel bir görüntüleme yöntemi geliştirdik9. Gerçekten de, bizim bakteriyel ekran sistemi tek bir seçim adım9aktif klonların bir >1.000.000 kat zenginleştirme sağlar , böylece roman BirA varyantları yönlendirilen evrim için etkili bir seçim sistemi sağlayan.
Bakteriyel titreşme sistemimiz, C-terminal 6xHis etiketine sahip BirA ve hedef peptidin yüzeyde görüntülenmesini sağlayan bir iskele proteini olmak üzere iki bileşenden oluşur. Biz iskelet proteini kullanılan dairesel permuted dış membran protein X (eCPX) peptidlerin etkili ekran hem De görülebilir beri- ve C-termini10,11. Hedef peptid dizisinin eCPX'in C-terminusuna füzyonu aktif BirA varyantlarını ifade eden bakterilerin biyotinylasyonunu sağlar. Bakteriler biyotinylated peptid şimdi yüzeyde görüntüler gibi etkili streptavidin seçimi için izin(Şekil 1a).
Bu yöntemin amacı, yerli proteinlerde bulunan peptit dizilerini biyotinylates BirA yeni varyantları için seçmektir. Sistem plazmid pBAD-BirA-eCPX-AP mevcut genler tarafından kodlanır, bir arabinose-indüklemez organizatörü BirA kontrol içeren (araBAD), ve bir T7 organizatörü eCPX kontrol9 (Şekil 1b). Bu protokol, hedef proteinden elde edilen bir peptitin eCPX'in C-terminaline dahil edilmesi, 2) hata yatkın PCR ile BirA mutasyonel kütüphanesinin oluşturulması, 3) streptavidin bağlayıcı bakterilerin seçilmesi için ayrıntılı prosedürü açıklar. manyetik aktive hücre tasnifikasyonu (MACS), 4) bakteri zenginleştirme nicelik, ve 5) izole klonların ilk karakterizasyonu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:747px;" width="747">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">10% precast polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:155px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4561033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">ApE - A plasmid editor v2.0</td>
			<td style="width:155px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Arabinose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMSO</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14200083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DpnI restriction enzyme</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PLN350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glycerol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">IPVH15150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">IPTG</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">LS Columns</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:307px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:155px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121907</td>
			<td>Used a template and positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td>
			<td style="width:155px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:119px;">121908</td>
			<td>negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0491</td>
			<td>For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">QuadroMACS Separator</td>
			<td style="width:155px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Skim Milk Powder</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:155px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P0397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T7 Express lysY/Iq Competent E. coli</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">C3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tryptone</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">T9410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tween-20</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td style="width:155px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">NEL103001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y1625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial peptide display for the selection of novel biotinylating enzymes

Biotin, proteinlerin izolasyonu ve tespiti için güçlü bir etiket sağlayan, çeviri sonrası çekici bir modifikasyondur. E. coli biotin-protein ligaz BirA tarafından enzimatik biyotinylasyon son derece spesifik tir ve hedef proteinlerin yerli ortamında biyotinylasyon sağlar; ancak, BirA aracılı biyotinylation mevcut kullanımı hedef protein sentetik bir kabul veya peptid (AP) varlığını gerektirir. Bu nedenle, uygulama AP içerecek şekilde tasarlanmış proteinler ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, peptidbiyoni yapan BirA varyantları için seçilen değiştirilmemiş bir hedef proteinden elde edilen bir peptitin bakteriyel ekranını kullanmaktır. Sistem bakteriyel yüzeyde peptit ekran için bir iskele ile birlikte BirA varyantları co-ifade sağlayan tek bir plazmid dayanmaktadır. Protokol, hedef peptidin ekran iskelesine dahil edilmesi, BirA kütüphanesinin oluşturulması, aktif BirA varyantlarının seçilmesi ve izole Edilmiş BirA varyantlarının ilk karakterizasyonu için ayrıntılı bir prosedürü açıklar. Bu yöntem, biyotin-protein ligaseslerinin daha da karmaşık çözeltilerde yerli proteini biyotinyle ile yönlendirilen evrimi için kullanılabilecek yeni BirA varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir seçim sistemi sağlar.

PBAD-BirA-eCPX-AP ifade bakterilerin Batı leke bir ~ 22 kDa streptavidin-eCPX moleküler ağırlığı ile tutarlı tepki bant üretir(Şekil 2a). BirA-6xHis'in aksine, biyotinylated eCPX-AP hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde(Şekil 2a)t7 promotör aktivitesi nin küçük bir derecesi nedeniyle bile uninduced kültürlerde ve endojen BirA tarafından AP sonraki biyotinylation mevcuttu. Kültürleri ifade eden ...

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes at JoVE.com

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Burada e. coli biotin-protein ligase BirA'nın belirli bir hedef peptidbiyominiyapan yeni varyantları için seçme yöntemi salıyoruz. Protokol, hedef peptidin bakteriyel olarak görüntülenmesi için bir plazmid yapımını, BirA kütüphanesinin neslinin, BirA varyantlarının seçilmesi ve karakterizasyonunun yapılmasını açıklar.

Roman Biyotinilasyon Enzimlerinin Seçimi için Bakteriyel Peptit Gösterimi

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Bu protokol, Yerli proteinlerin spesifik biyotinylasyonuna olanak tanıyan Bira'nın yeni varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir bakteriyel teşhir sistemi sağlar. Tekniğin en büyük avantajı, yüksek afinite streptavidin seçimi kullanarak BirA türevlerini seçmesidir. Bu, etkin olmayan klonların kaldırılmasını sağlayarak yüksek verimli bir seçim süreci oluşturur.Başlamak için, bir plazmid editörü, peptit kodlama dizisinin ters kompleman son 30 nükleotit içerecek şekilde ileri astar tasarımı ve beş asal sonuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisi ekleyin. Ters astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının ilk 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini beş asal ucuna ekleyin. Daha sonra, 20 mikrolitrelik PCR reaksiyonu ayarlamak için, ince duvarlı PCR tüpüne reaktifleri ekleyin.Tüpü bir termal döngüce aktarın ve el yazmasına göre PCR yapın. Daha sonra, altı kilobaz PCR ürün amplifikasyon onaylamak için% 1 agarose jel PCR reaksiyonu beş mikrolitre çalıştırın ve el yazmasına göre devam edin. Şimdi, bir PCR tüp bir Ileri ve ters astarlar ile Mutant megaprimers sentezlemek için, bir şablon olarak hazırlanan hedef peptid dizisi ile pBAD-BirA-eCPX bir nanogram ekleyin.Üreticinin talimatına göre 60 santigrat derecelik bir sıcaklıkla 35 PCR çevrimayarlayın. Daha sonra, 984 baz çifti PCR ürününün amplifikasyondoğrulamak için %1'lik agarose jelüzerinde amplifikasyon reaksiyonunun beş mikrolitresini çalıştırın. PCR ürününü, ticari bir PCR arıtma kiti kullanarak amplifikasyon reaksiyonunun kalan 45 mikrolitresinden arındırın ve DNA verimini belirlemek için bir spektrofotometre kullanın.İnce duvarlı bir PCR tüpünde, numune reaksiyonu hazırlamak için hazırlanan mutant megaprimerre reaktifleri ekleyin. Reaksiyon karışımını bir termal döngüce aktarın ve el yazmasına göre PCR'yi çalıştırın. Amplifikasyon reaksiyonu dört santigrat derecede veya buz üzerinde saklayın.Daha sonra, amplifikasyon reaksiyonu doğrudan Dpn1 restriksiyon enzimi bir mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırın. Reaksiyon karışımını aşağı çevirin ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yatın. İki saat sonra, T7 Express lysY/Iq yetkili E.coli hücrelerini dpn1 reaksiyonunun iki mikrolitresi ile bir tüpte dönüştürün.İlk olarak, 100 mililitre LB içeren 100 mililitre bir mililitre BirA kütüphanesi ile mililitre ampisilin başına 100 mikrogram, ve 200 rpm sallayarak 37 santigrat derece gecede kuluçka. Daha sonra, bir gecede kültürün 100 mikrolitre ile ampisilin mililitre başına 100 mikrogram glikoz ve 100 mikrogram içeren LB beş mililitre aşılamak. İki saat 30 dakika veya kültür yaklaşık 0,5 od600 ulaşana kadar kuluçka.Daha sonra, hacim L-arabinose, 100 mikromolar IPTG ve 100 mikromolar biotin tarafından% 0.2 ağırlık ile eCPX ve BirA ekspresyonu indükleyin. 37 santigrat derece bir saat için 200 rpm de kültür shake. 5, 000 kez g 10 dakika için kültür santrifüj ve supernatant kaldırın.Hücreleri bir mililitre buz gibi PBS'de yeniden askıya alın ve 5,000 kez g'de beş dakika santrifüj yapın. Supernatant atın ve buz gibi PBS 400 mikrolitre hücreleri yeniden askıya ve buz üzerinde hücreleri depolamak. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp giriş etiketli içine resuspended hücrelerin 10 mikrolitre aktarın.Buzda saklayın. Daha sonra, bir tüpte bir mililitre buz gibi PBS'de 20 mikrolitre streptavidin manyetik boncukyı yıkayın ve tüpü iki dakika boyunca bir tezgah üstü manyetik parçacık ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. 20 mikrolitre buz gibi PBS'deki streptavidin manyetik boncuklarını yeniden askıya alın ve boncuk çözeltisini önceki hazırlanmış 390 mikrolitre resuspended hücrelere aktarın.Yavaşça pipetleme ile karıştırın. Sonra, 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Bir manyetik parçacık ayırıcı içinde ferromanyetik küreler ile bir sütun yerleştirin ve buz gibi PBS beş mililitre ile yıkayın.Hücreleri ve streptavidin manyetik boncukları tüpten ayırıcıya bağlı kolona aktarın. Sütun haznesi boşaldıktan sonra, her seferinde 500 mikrolitre buz gibi PBS toplam hacmi ile sütunu yıkayın. Bundan sonra, ayırıcıdan sütunu çıkarın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Pipet sütun üzerine buz gibi PBS bir mililitre, ve manyetik etiketli hücreleri eute için piston kullanın. Daha sonra, 1,5 mililitrelik tüpü bir tezgah üstü ayırıcıya yerleştirin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreyi bir mililitre buz gibi PBS ile yıkayın. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri buz gibi pbs'nin bir mililitresinde yavaşça askıya alın.10 mikrolitre resuspension'yi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 100 mililitre LB içeren 100 mililitre mililitre ampisilin başına mililitre ampisilin içeren manyetik etiketli hücrelerle ve 200 rpm'de sallayarak bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, gliserol ile LB gecede kültürün 10 mililitre birleştirmek 15%son konsantrasyonve dondurucu stokları yapmak için eksi 80 santigrat derecede saklamak.Bir sonraki seçim turu için gece kültürünün 100 mikrolitresini kullanın. Şimdi, hem giriş hem de çıkış örneklerine 990 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin ve tüplerin girişini eksi ikiye 10 ve çıktıyı eksi ikiye 10 olarak etiketleyin. Giriş örneğinde 10 ila eksi 10 ve çıkış örneğinde eksi dörde 10'a ulaşana kadar buz gibi PBS'deki iki numunenin 10 kat seri seyreltmesini yapın.100 mikrolitre numune nin girişi 10'dan eksi altıya, giriş 10'dan eksi sekize, giriş 10'dan eksi 10'a, çıkış 10'dan eksi ikiye, çıkış 10'dan eksi üçe ve tek tek LB-ampisilin plakalarında eksi dörde 10 çıkış ve bir gecede 37 santigrat derece kuluçkaya yat. Sabah, açıkça ayrılmış koloniler ile plakalar üzerinde kolonilerin sayısını saymak. 100 mikrolitre başına bakteri konsantrasyonu sayısını elde etmek için koloni sayısını seyreltme faktörüyle çarpın.Bu protokolde, BirA varyantları, BirA ve eCPX-AP ifade rasgele mutasyona uğramış bir kütüphane nesil sonra indüklendi. Bakteriler yakınlık reaktifi ile kuluçkaya yatırıldı, bağlanmamış bakteriler atıldı ve seçilen bakteriler güçlendirildi. PBAD-BirA-eCPX-AP'nin bakterileri ifade eden batı daki blot'u, hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde eCPX'in moleküler ağırlığına uygun 22 kilodalton streptavidin-reacting band üretti.Ancak, BirA heksahistidine mevcut değildi. ECPX-AP'de bakterileri ifade eden güçlü yüzey biyotinylasyonu, streptavidin manyetik boncukların eklenmesi ve tüpün alt kısmında bir pelet oluşumu üzerine biraraya neden oldu, alanine mutasyon ekspresyonu bakterilere lizin ile eCPX ile gözlenmemiş. Streptavidin çekilmesinden çökelti analizi, eCPX-AP kültürlerinden alınan örneklerde 22 kilodalton streptavidin-reacting ve anti-heksahistidin bandı gösterdi, ancak eCPX-AP ile lizin ile alaninmutasyon kültürlerine kadar.Benzer şekilde, streptavidin boncuklarına bağlı bakteri sayısı eCPX-AP'de alanin mutasyon kültürlerine göre eCPX-AP lizinden anlamlı olarak daha yüksekti. En önemli adım streptavidin bağlı bakterilerin sıkı bir yıkama olduğunu. Sıkı bir yıkama sadece yüzey görüntülenen biotin ile bakteri seçilir sağlar.Bakterilerin net bir zenginleştirme gözlendikten sonra, izole klonlar daha da mutasyona uğrayabilir ve böylece yerli proteinlerin spesifik biyotinylation için izin son derece aktif BirA varyantları geliştirmek.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Termostabil Bacteriolytic Enzimlerin yönlendirilmiş evrimi için Yeni Tarama Yöntemi

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...