Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

ومن المسلم به أنيت Aakjær تومسن وخافيير غارسيا لدعم فني ممتاز. يشكر المؤلفون روبنز سبين نيتو على المناقشات المثمرة حول تحليل الصور.

تم استعراض بروتوكول جمع اللعاب والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات في مقاطعة آرهوس (M-20100032).
1. زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة
<ol><li>تنمو S. mutans DSM 20523 وC. albicans NCPF 3179 على لوحات أغار الدم في 37 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية.</li>
	<li>نقل مستعمرات واحدة من كل كائن حي لاخ?...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

بروتوكولات مختلفة لزراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تنطوي على C. albicans وStreptococcus spp. ومع ذلك ، يركز الإعداد الحالي على ظروف النمو البسيطة ، وجدول زمني متوافق مع أيام العمل العادية ، ?...

تشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تضم كلا من الأنواع الفطرية والبكتيرية في العديد من الحالات المرضية في تجويف الفم. المبيضات spp. وكثيرا ما تم عزلها من الالتهابات اللاقانية1 ومن آفات اللثة2،3. في الالتهابات المخاطية ، ثبت أن الأنواع العقدية من مجموعة التهاب الخلايا العضوية تعزز تكوين البيوفيلم الفطري ، وغزو الأنسجة ، والنشر في كل من نماذج المختبر والمورين4،5،6،7. الأكثر إثارة للاهتمام، وقد ثبت النقل عن طريق الفم من المبيضات spp. أن تكون مرتبطة مع انتشار التسوس في الأطفال8. كما هو مبين في نماذج القوارض ، فإن العلاقة التكافلية بين الموكانات العقدية والمبيضات البيض تزيد من إنتاج السكريات خارج الخلية وتؤدي إلى تكوين أفلام حيوية أكثر سمكًا وأكثر مسرطنة9،10.
في جميع الظروف المذكورة أعلاه ، تسوس الطفولة المبكرة على وجه الخصوص ، فإن درجة الحموضة في بيوفيلم ذات أهمية لتطور المرض ، والدور البارز لمصفوفة الأغشية الحيوية لتطوير البيئات الدقيقة الحمضية11 يدعو إلى منهجيات تسمح بدراسة تغيرات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة. وقد وضعت بسيطة ودقيقة النهج القائمة على المجهر confocal لرصد درجة الحموضة داخل البكتيريا12 والفطرية13 الأغشية الحيوية. مع صبغة النسبة C-SNARF-4 والصورة المستندة إلى العتبة بعد المعالجة ، يمكن تحديد درجة الحموضة خارج الخلية في الوقت الحقيقي في جميع الأبعاد الثلاثة للبيوفيلم14. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات المنشورة لرصد درجة الحموضة المستندة إلى المجهر في الأغشية الحيوية ، فإن قياس نسبة الحموضة مع C-SNARF-4 بسيط ورخيص ، لأنه لا يتطلب تركيب الجسيمات أو المركبات التي تتضمن صبغة مرجعية15 أو استخدام الإثارة ذات الفوتونين 16. استخدام صبغة واحدة فقط يمنع مشاكل مع تقسيم التحقيق، الفلورسنت تنزف من خلال، والتبييض الانتقائي16،17،18 في حين لا يزال يسمح للتمييز موثوق بها بين داخل وخارج الخلية درجة الحموضة. وأخيرا، يتم تنفيذ الحضانة مع الصبغة بعد نمو بيوفيلم، والذي يسمح بدراسة كل من المختبر وفي الأغشية الحيوية المزروعة في الموقع.
والهدف من هذا العمل هو توسيع نطاق استخدام قياس نسب الحموضة وتوفير طريقة لدراسة تغيرات درجة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة. كدليل على المفهوم ، يتم استخدام الطريقة لمراقبة درجة الحموضة في الأنواع الحيوية المزدوجة التي تتكون من S. mutans وC. albicans المعرضة للجلوكوز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

وتشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من كل من الخلايا الفطرية والبكتيرية في مجموعة متنوعة من أمراض الفم، مثل الالتهابات اللاقانية، والتهاب اللثة، والالتهابات المخاطية، وأبرزها تسوس الطفولة المبكرة. في كل هذه الظروف ، يؤثر درجة الحموضة في مصفوفة البيوفيلم على تفاعلات الميكروب والمضيف وبالتالي تطور المرض. ويصف البروتوكول الحالي طريقة مُحدّدة للتنظير المجهري لرصد ديناميات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتألف من المبيضات البيضوات وموتان المكورات العقدية. يتم استغلال الطيف ثنائي الانبعاثات المعتمد على درجة الحموضة وخصائص تلطيخ المسبار النسبةي C-SNARF-4 لتحديد القطرات في درجة الحموضة في المناطق خارج الخلية من الأغشية الحيوية. يتطلب استخدام قياس نسبة الأس الهيدروجيني مع المسبار اختيارًا دقيقًا لمعلمات التصوير ، ومعايرة شاملة للصبغة ، ومعالجة دقيقة تستند إلى العتبة بعد معالجة بيانات الصورة. عندما تستخدم بشكل صحيح، تسمح هذه التقنية للتقييم السريع للدرجة الحموضة خارج الخلية في مناطق مختلفة من بيوفيلم وبالتالي رصد كل من التدرجات درجة الحموضة الأفقية والعمودية مع مرور الوقت. في حين أن استخدام المجهر التكوري يحد من Z-profiling إلى أغشية حيوية رقيقة تبلغ 75 ميكرومتر أو أقل ، فإن استخدام قياس نسبة الحموضة مناسب بشكل مثالي للدراسة غير الباضعة لعامل الفوعة الهام في الأغشية الحيوية عبر المملكة.

بعد 24 ساعة و 48 ساعة، تطورت الأغشية الحيوية عبر المملكة القوية في لوحات البئر. C. أظهرت albicans درجات متفاوتة من النمو الخيطي، وشكلت S. mutans مجموعات كثيفة تصل إلى 35 ميكرون في الارتفاع. أشارت الخلايا والسلاسل المفردة من الموتانات S. مجمعة حول التنويم المغناطيسي الفطري ، والمساحات ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

يصف البروتوكول زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من المبيضات البيض وMutans العقدية ويقدم طريقة confocal المجهرية المستندة إلى رصد درجة الحموضة خارج الخلية داخل هذه الأغشية الحيوية.

رصد درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر كونكوالبؤر

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

ويقدم البروتوكول طريقة سهلة الأداء لزراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من العقدة. الطفرات والمبيضات ألبيكانس. يسمح قياس نسبة المجهر المستندة إلى المجهر اللاحقة بالرصد الدقيق للتطورات المتعلقة بالحمقط داخل المصفوفة خارج الخلية لتلك الأغشية الحيوية.الاختيار الدقيق للمعايير الحصول على الصور هو في غاية الأهمية للحصول على بيانات الصورة مع التباين كافية لتحليل لاحق. قياس نسبة الـ (pH) هو طريقة سريعة ودقيقة وغير مكلفة لدراسة تدرجات الـ PH الأفقية والرأسية في الأغشية الحيوية عبر المملكة في الوقت الحقيقي. ويمكن أيضا قياس نسبة الـ (pH) في الأغشية الحيوية الفطرية والبكتيرية البحتة.تساهم هذه الطريقة في زيادة فهمنا لعملية التمثيل الغذائي الميكروبي في الأغشية الحيوية. إثبات الإجراء لنمو بيو فيلم سيكون أنيت Aakjaer تومسن، وهو فني من مختبري. تنمو S.mutans و C.albicans على لوحات أجار الدم في 37 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية.ثم نقل مستعمرات واحدة من كل كائن حي لاختبار أنابيب مليئة بخمسة ملليلترات من ضخ القلب في الدماغ وتنمو لهم لمدة 18 ساعة إضافية. في اليوم التالي، والطرد المركزي الثقافات في 1، 200 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. Resuspend الخلايا في المالحة الفسيولوجية وضبط OD 550 إلى 0.5 لكل من C.albicans وS.mutans.ثم تمييع تعليق S.mutans 1-10 لتحقيق تركيزات مكافئة. الماصات 50 ميكرولترات من محلول معقمة اللعابية في آبار طبق 96-جيدا القاع البصرية للمجهر. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، ثم غسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من المالحة الفسيولوجية العقيمة وإفراغ الآبار.إضافة 100 ميكرولترات من تعليق C.albicans إلى كل بئر، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ثم غسل البئر ثلاث مرات مع المالحة. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة ساعتين، ثم غسله ثلاث مرات مع المالحة.إفراغ الآبار ولكن ترك خزان 20 ميكرولتر لتجنب قوات القص المفرطة. إضافة 100 ميكروليتر من تعليق S.mutans و 150 ميكرولترات من BHI مع 5٪ السكروز لكل بئر. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر.عند زراعة الأغشية الحيوية القديمة، استبدال المتوسط يوميا. في نهاية مرحلة النمو عبر المملكة، اغسل الطبق خمس مرات بالملوحة الفسيولوجية العقيمة. بالنسبة لتصوير نسبة قياس درجة هيدروكسي، استخدم مجهر مسح ليزر مقلوب مع عدسة 63X للنفط أو غمر الماء، وخط ليزر 543 نانومتر، ونظام تصوير طيفي.استخدام حاضنة لتدفئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية. ضبط كاشف للكشف في وقت واحد من الفلورسين الخضراء من 576 إلى 608 نانومتر وفلوريسنس الأحمر من 629 إلى 661 نانومتر. ثم اختر قوة الليزر المناسبة وكسب لتجنب أكثر وexexposure.تعيين حجم الثقب إلى وحدة الهواء واحد أو شريحة بصرية من حوالي 0.8 ميكرومتر. ثم قم بتعيين حجم الصورة إلى 512 في 512 بكسل وسرعة المسح الضوئي إلى اثنين. اختر متوسط بند اثنين باستخدام الخيار المتوسط.إعداد 100 ميكرولترات من المالحة الفسيولوجية العقيمة مع 0.4٪ الجلوكوز مُعزز إلى 7. ثم جعل حل الأسهم من C-SNARF-4 وإضافة الصبغة إلى تركيز النهائي من 30 ميكرومولار. إفراغ واحدة من الآبار مع بيو فيلم عبر المملكة ترك خزان 20 ميكرولتر وإضافة المالحة مع الجلوكوز وصبغة نسبة.ضع اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ التصوير. إعداد سلسلة من 50 ميليمولار MES العازلة مُعَد إلى درجة الH أربعة إلى 7.8 في الزيادات من وحدات 0.2 درجة مئوية في 35 درجة مئوية. ماصة 150 ميكرولترات من كل حل عازلة في آبار من أسفل بصري 96 جيدا لوحة.أضف الصبغة إلى الآبار المملوءة بالمخزن المؤقت بتركيز 30 ميكرومولار واتركها تهوي لمدة خمس دقائق. دافئة مرحلة المجهر إلى 35 درجة مئوية واختيار نفس الإعدادات كما للتصوير نسبة الرقم الH الموصوفة سابقا. ضع لوحة 96-well على مرحلة المجهر وركز على الجزء السفلي من الآبار.احصل على صور القنوات الخضراء والأحمر لجميع حلول المخزن المؤقت. على فترات منتظمة، التقاط الصور مع إيقاف تشغيل الليزر لتصحيح إزاحة كاشف. تنفيذ تجربة المعايرة في ثلاث ة و تصدير كافة الصور كملفات TIFF.تخزين الصور الخضراء والأحمر في مجلدات منفصلة وإعادة تسمية كل من سلسلة من الملفات مع أرقام متسلسلة. استيراد الصور إلى برامج مخصصة لتحليل الصور مثل ImageJ. في الصور التي تم التقاطها مع إيقاف تشغيل الليزر، انقر فوق التحليل والميوغراف البياني لتحديد متوسط كثافة الفلوريسنس.طرح هذه القيمة من الصور بيو فيلم عن طريق النقر على عملية، والرياضيات، والطرح. ثم استيراد اثنين من سلسلة الصور في دايم وتنفيذ تجزئة على أساس العتبة من الصور قناة حمراء عن طريق النقر على قطعة ، والتجزئة التلقائية ، والحد الأقصى المخصص. تعيين عتبة منخفضة فوق كثافة الفلوراسنس من السيتوبلازم الفطرية والعتبة العالية تحت كثافة جدران الخلايا الفطرية والبكتيريا.ثم نقل طبقة الكائن من سلسلة الصور المجزأة إلى سلسلة صورة القناة الخضراء عن طريق النقر على الجزء ونقل طبقة الكائن. حذف وحدات البكسل غير الكائن في سلسلة القنوات الحمراء والأخضر. الآن يتم مسح الصور بيو فيلم من الخلايا البكتيرية والفطرية ويمكن تصديرها كملفات TIFF.استيراد سلسلة الصور مرة أخرى إلى ImageJ وتقسيم سلسلة صورة حمراء في حد ذاته. ثم اضرب النتيجة في سلسلة الصور الأصلية. سلسلة الصور الناتجة مطابقة للأصل باستثناء إزالة كافة وحدات البكسل ذات الكثافة الصفرية.كرر العملية مع سلسلة الصور الخضراء. بعد ذلك، استخدم متوسط التصفية في كل من سلسلة الصور للتعويض عن ضوضاء الكاشف. تقسيم الأخضر على سلسلة صورة حمراء التي تسفر عن نسبة الأخضر إلى الأحمر لجميع بكسل الكائن.طوّرت قوّيّة عبر المملكة [بيو فيلم] في البئر لوحات بعد 24 و48 ساعات. وأشارت الخلايا والسلاسل المفردة من S.mutans مجمعة حول hyphae الفطرية والمساحات الكبيرة داخل الخلايا إلى وجود مصفوفة ضخمة. تم تصور قيم الـ pH في المساحة الخارجية الخلية باستخدام جدول بحث.انخفض مستوى السكر في الخلايا خارج الخلية في الأغشية الحيوية بسرعة في الدقائق الخمس الأولى بعد التعرض للجلوكوز. وبعد ذلك، تباطأت عملية التحمض لتصل عادة إلى قيم تتراوح بين 5.5 و5.8 بعد 15 دقيقة. بسبب التغيرات في درجة اله ( pH ) المحلية ، تغيرت شدة الفلورس في الأغشية الحيوية بمرور الوقت.أثناء تجزئة الصورة، تم اختيار عتبات عالية ومنخفضة للقضاء بشكل كاف على جميع المناطق التي تغطيها الخلايا البكتيرية والفطرية. وقد تم القضاء على المساحات الزرقاء والخضراء من خلال العتبات المنخفضة والعالية على التوالي. الاختيار الدقيق لبارامترات الحصول على الصور أمر بالغ الأهمية للحصول على تباين جيد بين الخلايا البكتيرية والخلايا الفطرية ومصفوفة البيوفيلم.إذا نمت الأغشية الحيوية عبر المملكة في خلايا التدفق، يمكن رصد التطورات pH تحت حالة تدفق تحاكي تلك الموجودة في تجويف الفم. وقد استخدمت قياس نسبة الحموضة لتحديد المناطق المحلية في الأغشية الحيوية الأسنان مع انخفاض الرقم الحموضة بشكل خاص، ما يسمى النقاط الساخنة الحمضية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

الكمي المتزامنة الخلوي ومكونات خارج الخلية من الأغشية الحيوية

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

التصوير Ratiometric الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...