Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Anette Aakjær Thomsen og Javier E. Garcia er anerkendt for fremragende teknisk support. Forfatterne takker Rubens Spin-Neto for frugtbare diskussioner om billedanalyse.

Protokollen for spytindsamling blev gennemgået og godkendt af Aarhus Amts Etiske Komité (M-20100032).
1. Dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget
<ol><li>Grow S. mutans DSM 20523 og C. albicans NCPF 3179 på blod agar plader ved 37 °C under aerobe forhold.</li>
	<li>Overfør enkelte kolonier af hver organisme til reagensglas fyldt med 5 ml hjernehjerteinfusion (BHI). Vokse i 18 timer under aerobe forhold ved 37 °C.</li>
	<li>Centrifugerne stiler nattens kulturer ved...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Der ertidligerebeskrevet forskellige protokoller for dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget C. albicans og Streptococcus spp. Men den nuværende opsætning fokuserer på enkle vækstbetingelser, en tidsplan forenelig med regelmæssige arbejdsdage, en afbalanceret artssammensætning og udviklingen af en voluminøs biofilmmatrix....

Biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter både svampe- og bakteriearter, er involveret i flere patologiske tilstande i mundhulen. Candida spp. er ofte blevet isoleret fra endodontiske infektioner1 og fra parodontale læsioner2,3. I slimhindeinfektioner, streptokok arter fra mitis gruppen har vist sig at øge svampebiofilm dannelse, væv invasion, og formidling i både in vitro og murine modeller4,5,6,7. Mest interessant, oral transport af Candida spp. har vist sig at være forbundet med forekomsten af caries hos børn8. Som vist i gnaver modeller, en symbiotisk forhold mellem Streptococcus mutans og Candidas albicans øger produktionen af ekstracellulære polysaccharider og fører til dannelsen af tykkere og mere kariogene biofilm9,10.
I alle ovennævnte betingelser, især førskolekarier, er biofilmpH af betydning for sygdomsprogression, og biofilmmatrixens fremtrædende rolle for udviklingen af acidogene mikromiljøer11 kræver metoder, der gør det muligt at studere pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Enkle og præcise konfokale mikroskopibaserede tilgange til at overvåge pH inde i bakterie12 og svampe13 biofilm er blevet udviklet. Med ratiometrisk farvestof C-SNARF-4 og tærskel-baseret billede efterbehandling, ekstracellulære pH kan bestemmes i realtid i alle tre dimensioner af en biofilm14. Sammenlignet med andre offentliggjorte teknikker til mikroskopibaseret pH-monitorering i biofilm er pH-ratiometri med C-SNARF-4 enkel og billig, fordi det ikke kræver syntese af partikler eller forbindelser, der omfatter et referencefarvestof15 eller brug af to-foton excitation16. Brugen af blot ét farvestof forhindrer problemer med sondeopdeling, fluorescerende udblødning og selektiv blegning16,17,18, mens der stadig er mulighed for en pålidelig differentiering mellem intra- og ekstracellulær pH. Endelig, inkubation med farvestoffet udføres efter biofilm vækst, som gør det muligt at studere både laboratorium og in situ-dyrkede biofilm.
Formålet med dette arbejde er at udvide anvendelsen af pH-ratiometri og tilvejebringe en metode til undersøgelse af pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Som proof of concept anvendes metoden til at overvåge pH i bifilm af to arter bestående af S. mutans og C. albicaner, der udsættes for glukose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Biofilm på tværs af kongeriget, der består af både svampe- og bakterieceller, er involveret i en række orale sygdomme, såsom endodontiske infektioner, parodontitis, slimhindeinfektioner og især tidlige barndomscaries. Under alle disse betingelser påvirker pH i biofilmmatrixen mikrober-vært interaktioner og dermed sygdomsprogression. Denne protokol beskriver en konfokal mikroskopibaseret metode til overvågning af pH-dynamikken i biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter Candida albicans og Streptococcus mutans. Den pH-afhængige dual-emission spektrum og farvning egenskaber ratiometric sonde C-SNARF-4 udnyttes til at bestemme dråber i pH i ekstracellulære områder af biofilm. Brug af pH-ratiometri med sonden kræver et omhyggeligt udvalg af billeddannelsesparametre, en grundig kalibrering af farvestoffet og omhyggelig, tærskelbaseret efterbehandling af billeddataene. Når teknikken anvendes korrekt, giver den mulighed for hurtig vurdering af ekstracellulær pH i forskellige områder af en biofilm og dermed overvågning af både vandrette og lodrette pH-gradienter over tid. Mens brugen af konfokalmikroskopi begrænser Z-profilering til tynde biofilm på 75 μm eller derunder, er brugen af pH-ratiometri ideel til noninvasive undersøgelse af en vigtig virulensfaktor i biofilm på tværs af kongeriget.

Efter 24 timer og 48 h, robuste cross-kingdom biofilm udviklet i brønden plader. C. albicans viste varierende grader af filamentous vækst, og S. mutans dannede tætte klynger på op til 35 μm i højden. Enkelte celler og kæder af S. mutans grupperet omkring svampe hyphae, og store intercellulære rum angivet tilstedeværelsen af en voluminøs matrix (Figur S1).
Kalibrering af det ratiometriske farvestof giver en asymmetrisk sigmoidalkurve<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Protokollen beskriver dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget bestående af Candida albicans og Streptococcus mutans og præsenterer en konfokalmikroskopibaseret metode til overvågning af ekstracellulær pH inde i disse biofilm.

Overvågning af ekstracellulære pH-pc'er i Biofilm på tværs af kongeriget ved hjælp af konfokalmikroskopi

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Protokollen præsenterer en nem at udføre metode til dyrkning af cross-kingdom biofilm bestående af StreptococcuS. mutans og Candida albicans. Efterfølgende konfokal mikroskopi-baseret pH-ratiometri giver mulighed for nøjagtig overvågning af pH-udviklingen inde i den ekstracellulære matrix af disse biofilm.Det omhyggelige valg af billederhvervelsesparametre er af allerstørste betydning for at opnå billeddata med tilstrækkelig kontrast til efterfølgende analyse. pH ratiometri er en hurtig, præcis og billig metode til at studere både vandrette og lodrette pH-gradienter i cross-kingdom biofilm i realtid. pH ratiometri kan også udføres i rent svampe og bakterielle biofilm.Metoden bidrager til at øge vores forståelse af mikrobiel metabolisme i biofilm. Påvisning af proceduren for biofilmvækst vil Anette Aakjaer Thomsen, en tekniker fra mit laboratorium. Grow S.mutans og C.albicans på blod agar plader ved 37 grader Celsius under aerobe forhold.Derefter overføre enkelte kolonier af hver organisme til reagensglas fyldt med fem milliliter hjerne hjerte infusion og dyrke dem i yderligere 18 timer. Den næste dag centrifuger kulturerne ved 1,200 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Resuspend cellerne i fysiologisk saltvand og justere OD 550 til 0,5 for både C.albicans og S.mutans.Derefter fortyndes S.mutans suspension en til 10 for at opnå tilsvarende koncentrationer. Pipette 50 mikroliter steril spytopløsning i brøndene på en optisk bund 96-brøndplade til mikroskopi. Inkuber pladen i 30 minutter ved 37 grader Celsius, vask derefter pladen tre gange med 100 mikroliter sterilt fysiologisk saltvand og tøm brøndene.Tilsæt 100 mikroliter af C.albicans suspension til hver brønd, inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 90 minutter, derefter vaske brønden tre gange med saltvand. Dernæst tilsættes 100 mikroliter varme-inaktiveret føtal kvæg serum til hver brønd. Inkuber pladen i to timer, og vask den derefter tre gange med saltvand.Tøm brøndene, men efterlad en 20 mikroliter reservoir for at undgå overdreven forskydning kræfter. Tilføj 100 mikroliter S.mutans suspension og 150 mikroliter BHI med 5% saccharose til hver brønd. Derefter inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 24 timer eller længere.Når du dyrker ældre biofilm, erstatte mediet dagligt. I slutningen af tværsriget vækstfase, vaskes pladen fem gange med sterilt fysiologisk saltvand. Til ratiometrisk pH-billeddannelse skal du bruge et omvendt konfokalt laserscanningsmikroskop med et 63X olie- eller vandsænkningslinse, en 543 nanometerlaserlinje og et spektralt billedsystem.Brug en kuvøse til at opvarme mikroskopet fase til 35 grader Celsius. Indstil detektoren til samtidig påvisning af grøn fluorescens fra 576 til 608 nanometer og rød fluorescens fra 629 til 661 nanometer. Vælg derefter en passende laser magt og gevinst for at undgå over og undereksponering.Indstil pinhole-størrelsen til én luftenhed eller en optisk skive på ca. 0,8 mikrometer. Indstil derefter billedstørrelsen til 512 gange 512 pixel og scanningshastigheden til to. Vælg et linjegennemsnit på to ved hjælp af middelværdiindstillingen.Forbered 100 mikroliter sterilt fysiologisk saltvand med 0,4% glukose titreret til pH syv. Derefter laves en lageropløsning af C-SNARF-4 og tilsæt farvestoffet til en endelig koncentration på 30 mikromolar. Tøm en af brøndene med cross-kingdom biofilm forlader en 20 mikroliter reservoir og tilsæt saltvand med glukose og ratiometrisk farvestof.Ansting pladen på mikroskopstadiet, og begynd at billeddannelse. Forbered en serie på 50 millimolar MES buffer titreret til pH fire til 7,8 i intervallerne på 0,2 pH-enheder ved 35 grader Celsius. Pipette 150 mikroliter af hver bufferopløsning i brøndene på en optisk bundplade på 96 brønde.Tilsæt farvestoffet til de bufferfyldte brønde i en koncentration på 30 mikromolar og lad det ligevægte i fem minutter. Varm mikroskopstadiet til 35 grader Celsius, og vælg de samme indstillinger som for ratiometrisk pH-billeddannelse, der tidligere er beskrevet. Placer 96-brøndpladen på mikroskopscenen, og fokuser på bunden af brøndene.Anskå grønne og røde kanalbilleder til alle bufferløsninger. Tag med jævne mellemrum billeder med laseren slået fra for at korrigere for detektorforskydning. Udfør kalibreringseksperimentet i tre eksemplarer, og eksportér alle billeder som TIFF-filer.Gem de grønne og røde billeder i separate mapper, og omdøb begge serier af filer med sekventielle numre. Importer billederne til dedikeret billedanalysesoftware som ImageJ. I de billeder, der tages med laseren slukket, skal du klikke analysere og histogram for at bestemme den gennemsnitlige fluorescens intensitet.Træk denne værdi fra biofilmbillederne ved at klikke på proces, matematik og trække fra. Importer derefter de to billedserier til daime, og udfør en tærskelbaseret segmentering af billederne af den røde kanal ved at klikke på segment, automatisk segmentering og brugerdefineret tærskel. Indstil den lave tærskel over fluorescensintensiteten af svampecytoplasmaet og den høje tærskel under intensiteten af svampecellevæggene og bakterierne.Overfør derefter objektlaget i den segmenterede billedserie til billedserien for grønne kanaler ved at klikke på segment og overføre objektlag. Slet pixel, der ikke er objekt, i serien med røde og grønne kanaler. Nu biofilm billeder er ryddet fra bakterielle og svampeceller og kan eksporteres som TIFF-filer.Importer billedserien tilbage til ImageJ, og opdel den røde billedserie alene. Multiplicer derefter resultatet med den oprindelige billedserie. Den resulterende billedserie er identisk med originalen, medmindre alle nulintensitetspixel fjernes.Gentag processen med den grønne billedserie. Brug derefter middelfilteret på begge billedserier for at kompensere for detektorstøj. Divider greenen med den røde billedserie, som derefter giver det grøn-røde forhold for alle objektpixel.Robuste biofilm fra tværs af kongeriget udviklet i brøndpladerne efter 24 og 48 timer. Enkeltceller og kæder af S.mutans grupperet omkring svampehyfa og store intracellulære rum indikerede tilstedeværelsen af en voluminøs matrix. PH i det ekstracellulære rum blev visualiseret ved hjælp af en opslagstabel.Den ekstracellulære pH i biofilm faldt hurtigt i de første fem minutter efter udsættelse for glukose. Derefter, forsuring bremset typisk nå værdier på 5,5 til 5,8 efter 15 minutter. På grund af de lokale pH-ændringer ændrede fluorescensintensiteten i biofilmene sig over tid.Under billedsegmentering blev der valgt høje og lave tærskler for på passende vis at fjerne alle områder, der er dækket af bakterie- og svampeceller. De blå og grønne områder blev elimineret af henholdsvis de lave og høje tærskler. Det omhyggelige valg af billedopkøbsparametre er afgørende for at opnå en god kontrast mellem bakterieceller, svampeceller og biofilmmatrixen.Hvis cross-kingdom biofilm dyrkes i flowceller, pH udvikling kan overvåges under flow tilstand efterligne dem i mundhulen. pH ratiometri er blevet anvendt til at identificere lokalområder i dental biofilm med særligt lav pH, såkaldte sureogene hotspots.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encellede Analyse af Bacillus subtilis Biofilm Brug fluorescensmikroskopi og Flowcytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling fagosom pH ved Ratiometrisk fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Ratiometrisk Imaging af ekstracellulære pH i Dental biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...