Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
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Anette Aakjor Thomsen et Javier E. Garcia sont reconnus pour leur excellent soutien technique. Les auteurs remercient Rubens Spin-Neto pour les discussions fructueuses sur l'analyse d'images.

Le protocole pour la collecte de salive a été examiné et approuvé par le comité d'éthique du comté d'Aarhus (M-20100032).
1. Cultivation de biofilms de cross-kingdom
<ol><li>Cultivez S. mutans DSM 20523 et C. albicans NCPF 3179 sur des plaques d'agar de sang à 37 oC dans des conditions aérobies.</li>
	<li>Transférer des colonies uniques de chaque organisme dans des tubes à essai remplis de 5 ml d'infusion cardiaque cérébrale (BHI). Cultivez pendant 18 h dans de...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Différents protocoles pour la culture de biofilms inter-royaume impliquant C. albicans et Streptococcus spp. ont été décrits précédemment9,22,23,24,25. Cependant, la configuration actuelle se concentre sur des conditions de croissance simples, un calendrier compatible avec les journées de travail régulières, une composition ...

Les biofilms de cross-kingdom comprenant des espèces fongiques et bactériennes sont impliqués dans plusieurs conditions pathologiques dans la cavité buccale. Candida spp. ont souvent été isolés des infections endodontiques1 et des lésions parodontales2,3. Dans les infections muqueuses, les espèces streptococciques du groupe de mitis ont été montrées pour augmenter la formation de biofilm fongique, l'invasion de tissu, et la diffusion dans les modèles in vitro etmurines 4,5,6,7. Plus intéressant encore, le transport oral de Candida spp. a été prouvé pour être associé à la prévalence des caries chez les enfants8. Comme le montrent les modèles de rongeurs, une relation symbiotique entre Streptococcus mutans et Candidas albicans augmente la production de polysaccharides extracellulaires et conduit à la formation de biofilms plus épais et plus cariogéniques9,10.
Dans toutes les conditions susmentionnées, les caries de la petite enfance en particulier, le pH du biofilm est important pour la progression de la maladie, et le rôle éminent de la matrice biofilm pour le développement de microenvironnements acidogéniques11 exige des méthodologies qui permettent d'étudier les changements de pH à l'intérieur des biofilms inter-royaume. Des approches simples et précises basées sur la microscopie confocale pour surveiller le pH à l'intérieur des biofilmsbactériens 12 et fongiques13 ont été développées. Avec le colorant ratiométrique C-SNARF-4 et le post-traitement de l'image basé sur le seuil, le pH extracellulaire peut être déterminé en temps réel dans les trois dimensions d'un biofilm14. Comparé à d'autres techniques éditées pour la microscopie-basée pH-surveillance dans les biofilms, la ratiométrie de pH avec C-SNARF-4 est simple et bon marché, parce qu'elle ne nécessite pas la synthèse des particules ou des composés qui incluent un colorant de référence15 ou l'utilisation de l'excitation de deux-photon16. L'utilisation d'un seul colorant empêche les problèmes de compartimentation de sonde, de saignement fluorescent-à travers, et de blanchiment sélectif16,17,18 tout en permettant une différenciation fiable entre le pH intra- et extracellulaire. Enfin, l'incubation avec le colorant est effectuée après la croissance du biofilm, ce qui permet d'étudier à la fois les biofilms en laboratoire et in situ.
L'objectif du présent travail est d'étendre l'utilisation de la ratiométrie du pH et de fournir une méthode pour étudier les changements de pH dans les biofilms inter-royaume. Comme preuve de concept, la méthode est utilisée pour surveiller le pH dans les biofilms à deux espèces composés de S. mutans et De C. albicans exposés au glucose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Les biofilms transversaux composés de cellules fongiques et bactériennes sont impliqués dans une variété de maladies buccales, telles que les infections endodontiques, la parodontite, les infections muqueuses et, plus particulièrement, les caries de la petite enfance. Dans toutes ces conditions, le pH de la matrice de biofilm influe sur les interactions microbe-hôte et donc la progression de la maladie. Le protocole actuel décrit une méthode à base de microscopie confocale pour surveiller la dynamique du pH à l'intérieur des biofilms transversaux comprenant Candida albicans et Streptococcus mutans. Le spectre à double émission dépendant du pH et les propriétés de coloration de la sonde ratiométrique C-SNARF-4 sont exploités pour déterminer les baisses de pH dans les zones extracellulaires des biofilms. L'utilisation de la ratiométrie de pH avec la sonde nécessite un choix méticuleux de paramètres d'imagerie, un étalonnage approfondi du colorant et un post-traitement minutieux basé sur le seuil des données d'image. Lorsqu'elle est utilisée correctement, la technique permet l'évaluation rapide du pH extracellulaire dans différentes zones d'un biofilm et donc la surveillance des gradients de pH horizontaux et verticaux au fil du temps. Alors que l'utilisation de la microscopie confocale limite le profilage Z à des biofilms minces de 75 m ou moins, l'utilisation de la ratiométrie du pH est idéalement adaptée à l'étude non invasive d'un facteur de virulence important dans les biofilms de l'ensemble du royaume.

Après 24 h et 48 h, de robustes biofilms croisés se sont développés dans les plaques de puits. C. albicans a montré des degrés variables de croissance filamentuse, et S. mutans a formé des amas denses de jusqu'à 35 m de hauteur. Les cellules et les chaînes simples de S. mutans regroupées autour d'hyphes fongiques, et de grands espaces intercellulaires indiquaient la présence d'une matrice volumineuse (Figure S1).
Calibration du colorant ra...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Le protocole décrit la culture de biofilms inter-royaume s'composés de Candida albicans et Streptococcus mutans et présente une méthode confocale basée sur la microscopie pour la surveillance du pH extracellulaire à l'intérieur de ces biofilms.

Surveillance du pH extracellulaire dans les biofilms Cross-Kingdom à l'aide de la microscopie confocale

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Le protocole présente une méthode facile à exécuter pour la culture de biofilms trans-royaume composé de StreptococcuS. mutans et Candida albicans. La ratiométrie confocale subséquente du pH à base de microscopie permet une surveillance précise des développements du pH à l’intérieur de la matrice extracellulaire de ces biofilms.Le choix minutieux des paramètres d’acquisition d’images est de la plus haute importance pour obtenir des données d’image avec un contraste suffisant pour une analyse ultérieure. La ratiométrie du pH est une méthode rapide, précise et peu coûteuse pour étudier les gradients de pH horizontaux et verticaux dans les biofilms trans-royaume en temps réel. La ratiométrie du pH peut également être effectuée dans des biofilms purement fongiques et bactériens.La méthode contribue à accroître notre compréhension du métabolisme microbien dans les biofilms. Anette Aakjaer Thomsen, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure de croissance du biofilm. Cultivez des S.mutans et des C.albicans sur des plaques d’agar sanguin à 37 degrés Celsius dans des conditions aérobies.Transférez ensuite des colonies simples de chaque organisme à des tubes à essai remplis de cinq millilitres d’infusion cardiaque cérébrale et cultivez-les pendant 18 heures supplémentaires. Le lendemain, centrifuger les cultures à 1200 g pendant cinq minutes et jeter le surnatant. Resuspendez les cellules en solution saline physiologique et ajustez l’OD 550 à 0,5 pour les C.albicans et les S.mutans.Ensuite, diluer la suspension S.mutans un à 10 pour atteindre des concentrations équivalentes. Pipette 50 microlitres de solution salivaire stérile dans les puits d’une plaque optique de fond de 96 puits pour la microscopie. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis laver la plaque trois fois avec 100 microlitres de solution saline physiologique stérile et vider les puits.Ajouter 100 microlitres de suspension C.albicans à chaque puits, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis laver le puits trois fois avec de la solution saline. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur à chaque puits. Incuber la plaque pendant deux heures, puis la laver trois fois avec de la solution saline.Videz les puits mais laissez un réservoir de 20 microlitres pour éviter les forces de cisaillement excessives. Ajouter 100 microlitres de suspension S.mutans et 150 microlitres de BHI avec 5% de saccharose à chaque puits. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures ou plus.Lorsque vous cultivez des biofilms plus anciens, remplacez le milieu tous les jours. À la fin de la phase de croissance entre royaume, laver la plaque cinq fois avec stérile physiologique saline. Pour l’imagerie par pH ratiométrique, utilisez un microscope à balayage laser confocal inversé avec une lentille d’immersion d’huile ou d’eau 63X, une ligne laser de 543 nanomètres et un système d’imagerie spectrale.Utilisez un incubateur pour réchauffer le stade du microscope à 35 degrés Celsius. Réglez le détecteur pour la détection simultanée de la fluorescence verte de 576 à 608 nanomètres et de la fluorescence rouge de 629 à 661 nanomètres. Choisissez ensuite une puissance laser appropriée et gagnez pour éviter la surexposition et la sous-exposition.Réglez la taille du sténopé sur une unité d’air ou une tranche optique d’environ 0,8 micromètre. Réglez ensuite la taille de l’image à 512 par 512 pixels et la vitesse d’analyse à deux. Choisissez une moyenne de deux lignes en utilisant l’option moyenne.Préparez 100 microlitres de solution saline physiologique stérile avec 0,4% de glucose titré au pH sept. Ensuite, faire une solution de stock de C-SNARF-4 et ajouter le colorant à une concentration finale de 30 micromolaires. Videz l’un des puits avec le biofilm cross-kingdom en laissant un réservoir de 20 microlitres et ajoutez la solution saline avec du glucose et du colorant ratiométrique.Placez la plaque au stade du microscope et commencez l’imagerie. Préparez une série de tampons MES de 50 millimilliles titrés au pH quatre à 7,8 par incréments de 0,2 pH à 35 degrés Celsius. Pipette 150 microlitres de chaque solution tampon dans les puits d’une plaque optique de fond de 96 puits.Ajouter le colorant aux puits remplis de tampon à une concentration de 30 micromolaires et laisser équilibrer pendant cinq minutes. Réchauffez le stade du microscope à 35 degrés Celsius et choisissez les mêmes paramètres que pour l’imagerie par pH ratiométrique décrite précédemment. Placez la plaque de 96 puits au microscope et concentrez-vous sur le fond des puits.Acquérir des images de canaux verts et rouges pour toutes les solutions tampons. À intervalles réguliers, prendre des images avec le laser éteint pour corriger le décalage du détecteur. Effectuez l’expérience d’étalonnage en triplicate et exportez toutes les images sous forme de fichiers TIFF.Stockez les images vertes et rouges dans des dossiers distincts et renommez les deux séries de fichiers avec des numéros séquentiels. Importez les images dans des logiciels d’analyse d’images dédiés tels que ImageJ. Dans les images prises avec le laser éteint, cliquez sur analyser et histogramme pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence.Soustrayez cette valeur des images du biofilm en cliquant sur le processus, les mathématiques et soustrayez. Ensuite, importez les deux séries d’images en daime et effectuez une segmentation basée sur le seuil des images du canal rouge en cliquant sur le segment, la segmentation automatique et le seuil personnalisé. Placez le seuil bas au-dessus de l’intensité de fluorescence du cytoplasme fongique et du seuil élevé au-dessous de l’intensité des parois fongiques cellulaires et des bactéries.Transférez ensuite la couche objet de la série d’images segmentée à la série d’images de canal vert en cliquant sur le segment et en transférant la couche d’objet. Supprimez les pixels non-objet dans la série de canaux rouges et verts. Maintenant, les images de biofilm sont effacées des cellules bactériennes et fongiques et peuvent être exportées sous forme de fichiers TIFF.Importez la série d’images dans ImageJ et divisez la série d’images rouges par elle-même. Ensuite, multipliez le résultat par la série d’images d’origine. La série d’images qui en résulte est identique à l’original, sauf que tous les pixels d’intensité zéro sont supprimés.Répétez le processus avec la série d’images vertes. Ensuite, utilisez le filtre moyen sur les deux séries d’images pour compenser le bruit du détecteur. Divisez le vert par la série d’images rouges qui donne ensuite le rapport vert-rouge pour tous les pixels d’objets.De robustes biofilms cross-kingdom se sont développés dans les plaques de puits après 24 et 48 heures. Les cellules simples et les chaînes de S.mutans regroupées autour des hyphes fongiques et des grands espaces intracellulaires indiquaient la présence d’une matrice volumineuse. Le pH dans l’espace extracellulaire a été visualisé à l’aide d’une table de recherche.Le pH extracellulaire dans les biofilms a chuté rapidement dans les cinq premières minutes après l’exposition au glucose. Par la suite, l’acidification a ralenti atteignant généralement des valeurs de 5,5 à 5,8 après 15 minutes. En raison des changements locaux de pH, l’intensité de fluorescence dans les biofilms a changé avec le temps.Lors de la segmentation de l’image, des seuils élevés et bas ont été choisis pour éliminer adéquatement toutes les zones couvertes par les cellules bactériennes et fongiques. Les zones bleues et vertes ont été éliminées par les seuils bas et élevés respectivement. Le choix minutieux des paramètres d’acquisition d’image est crucial pour obtenir un bon contraste entre les cellules bactériennes, les cellules fongiques et la matrice de biofilm.Si les biofilms trans-royaume sont cultivés dans les cellules d’écoulement, les développements de pH peuvent être surveillés dans l’état de flux imitant ceux dans la cavité buccale. La ratiométrie du pH a été utilisée pour identifier les zones locales dans les biofilms dentaires dont le pH est particulièrement faible, ce qu’on appelle les points chauds acidogènes.

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