Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Für den hervorragenden technischen Support wurden Anette Aakjér Thomsen und Javier E. Garcia ausgezeichnet. Die Autoren danken Rubens Spin-Neto für fruchtbare Diskussionen zur Bildanalyse.

Das Protokoll zur Speichelsammlung wurde von der Ethikkommission des Kreises Aarhus (M-20100032) überprüft und genehmigt.
1. Kultivierung von cross-kingdom Biofilmen
<ol><li>Wachsen Sie S. mutans DSM 20523 und C. albicans NCPF 3179 auf Blut-Agar-Platten bei 37 °C unter aeroben Bedingungen.</li>
	<li>Übertragen Sie einzelne Kolonien jedes Organismus auf Reagenzgläser, die mit 5 ml Hirninfusion (BHI) gefüllt sind. 18 stunden unter aeroben Bedingungen bei 37 °C wachsen....

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Verschiedene Protokolle für den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen mit C. albicans und Streptococcus spp. wurdenzuvor9,22,23,24,25beschrieben. Das derzeitige Setup konzentriert sich jedoch auf einfache Wachstumsbedingungen, einen Zeitplan, der mit regulären Arbeitstagen kompatibel ist, eine ausgewogene Artenzusammensetz...

Reichübergreifende Biofilme, die sowohl Pilz- als auch Bakterienarten umfassen, sind an mehreren pathologischen Erkrankungen in der Mundhöhle beteiligt. Candida spp. wurden häufig von endodontischen Infektionenisoliert 1 und von parodontalen Läsionen2,3. Bei Schleimhautinfektionen haben Streptokokkenarten aus der Mitis-Gruppe gezeigt, dass sie die Bildung von Pilzbiofilm, die Gewebeinvasion und die Verbreitung in den In-vitro- und Murine-Modellen4,5,6,7verbessern. Am interessantesten ist, mündliche Beförderung von Candida spp. hat sich als mit der Prävalenz von Karies bei Kindernverbunden 8. Wie in Nagetiermodellen gezeigt, erhöht eine symbiotische Beziehung zwischen Streptococcus mutans und Candidas albicans die Produktion von extrazellulären Polysacchariden und führt zur Bildung dickerer und karogener Biofilme9,10.
Unter allen oben genannten Bedingungen, insbesondere frühkindlichen Karies, ist der pH-Wert des Biofilms von Bedeutung für die Krankheitsprogression, und die herausragende Rolle der Biofilmmatrix für die Entwicklung von säureogenen Mikroumgebungen11 erfordert Methoden, die die Untersuchung von pH-Veränderungen innerhalb von bio-kingdomübergreifenden Biofilmen ermöglichen. Es wurden einfache und genaue konfokale Mikroskopie-basierte Ansätze zur Überwachung des pH-Werts in bakteriellen12 undPilz13 Biofilmen entwickelt. Mit dem ratiometrischen Farbstoff C-SNARF-4 und der schwellenbasierten Bildnachbearbeitung kann der extrazelluläre pH in Echtzeit in allen drei Dimensionen eines Biofilms14bestimmt werden. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Techniken zur mikroskopischen pH-Überwachung in Biofilmen ist die pH-Ratiometrie mit C-SNARF-4 einfach und kostengünstig, da sie nicht die Synthese von Partikeln oder Verbindungen erfordert, die einen Referenzfarbstoff15 oder die Verwendung von Zwei-Photonen-Erregung16enthalten. Die Verwendung von nur einem Farbstoff verhindert Probleme mit der Sondenkomdtalisation, fluoreszierenden Durchblutungen und selektivem Bleichen16,17,18 und ermöglicht gleichzeitig eine zuverlässige Differenzierung zwischen intra- und extrazellulärem pH-Wert. Schließlich erfolgt die Inkubation mit dem Farbstoff nach dem Biofilmwachstum, das es ermöglicht, sowohl Labor- als auch in situ-gewachsene Biofilme zu untersuchen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Verwendung der pH-Ratiometrie zu erweitern und eine Methode zur Untersuchung von pH-Veränderungen in grenzüberschreitenden Biofilmen bereitzustellen. Als Proof of Concept wird die Methode zur Überwachung des pH-Werts in Biofilmen mit zwei Arten, bestehend aus S. Mutans und C. albicans, die Glukose ausgesetzt sind, verwendet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Reichübergreifende Biofilme, die aus Pilz- und Bakterienzellen bestehen, sind an einer Vielzahl von Oralerkrankungen beteiligt, wie endodontische Infektionen, Parodontitis, Schleimhautinfektionen und vor allem frühkindliche Karies. Unter all diesen Bedingungen wirkt sich der pH-Wert in der Biofilmmatrix auf Mikroben-Wirt-Wechselwirkungen und damit auf das Krankheitsverlauf aus. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung der pH-Dynamik innerhalb königreichübergreifender Biofilme, die Candida-Albicans und Streptococcus-Mutane umfassen. Das pH-abhängige Dual-Emissions-Spektrum und die Färbeeigenschaften der ratiometrischen Sonde C-SNARF-4 werden genutzt, um pH-Tropfen in extrazellulären Bereichen der Biofilme zu bestimmen. Die Verwendung der pH-Ratiometrie mit der Sonde erfordert eine sorgfältige Auswahl der bildgebenden Parameter, eine gründliche Kalibrierung des Farbstoffs und eine sorgfältige, schwellenbasierte Nachbearbeitung der Bilddaten. Bei richtiger Verwendung ermöglicht die Technik die schnelle Beurteilung des extrazellulären pH-Werts in verschiedenen Bereichen eines Biofilms und damit die Überwachung von horizontalen und vertikalen pH-Gradienten im Zeitverlauf. Während die Verwendung der konfokalen Mikroskopie die Z-Profilierung auf dünne Biofilme von 75 m oder weniger beschränkt, eignet sich die Verwendung der pH-Ratiometrie ideal für die nichtinvasive Untersuchung eines wichtigen Virulenzfaktors in reichübergreifenden Biofilmen.

Nach 24 h und 48 h entwickelten sich in den Brunnenplatten robuste, reichübergreifende Biofilme. C. Albicans zeigten unterschiedliche Grade des fadenförmigen Wachstums, und S. Mutane bildeten dichte Cluster von bis zu 35 m Höhe. Einzelne Zellen und Ketten von S. Mutanen, gruppiert um Pilzhyphen, und große interzelluläre Räume zeigten das Vorhandensein einer voluminösen Matrix an (Abbildung S1).
Die Kalibrierung des ratiometrischen Farbstoffs e...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.

Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Das Protokoll stellt eine einfach durchzuführende Methode für den Anbau von reichsübergreifenden Biofilmen dar, die aus StreptococcuS bestehen. Mutans und Candida albicans. Die anschließende konfokale Mikroskopie-basierte pH-Ratiometrie ermöglicht eine genaue Überwachung der pH-Entwicklungen innerhalb der extrazellulären Matrix dieser Biofilme.Die sorgfältige Wahl der Bildaufnahmeparameter ist von größter Bedeutung, um Bilddaten mit ausreichendem Kontrast für die nachfolgende Analyse zu erhalten. pH-Ratiometrie ist eine schnelle, präzise und kostengünstige Methode, um sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten in kingdomübergreifenden Biofilmen in Echtzeit zu untersuchen. pH-Ratiometrie kann auch in rein pilzlichen und bakteriellen Biofilmen durchgeführt werden.Die Methode trägt dazu bei, unser Verständnis des mikrobiellen Stoffwechsels in Biofilmen zu erhöhen. Demonstriert das Verfahren für das Biofilmwachstum wird Anette Aakjaer Thomsen, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Wachsen Sie S.mutans und C.albicans auf Blut-Agar-Platten bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen.Dann übertragen Sie einzelne Kolonien jedes Organismus auf Reagenzgläser gefüllt mit fünf Milliliter Hirninfusion und wachsen sie für weitere 18 Stunden. Zentrifugieren Sie am nächsten Tag die Kulturen fünf Minuten lang bei 1,200 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in physiologischer Salzlinie wieder aus und passen Sie die OD 550 auf 0,5 für C.albicans und S.mutans an.Verdünnen Sie dann die S.mutans Suspension eins bis zehn, um gleichwertige Konzentrationen zu erreichen. Pipette 50 Mikroliter sterile Speicheldrüsenlösung in die Brunnen einer optischen 96-Well-Platte für die Mikroskopie. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, dann waschen Sie die Platte dreimal mit 100 Mikroliter steriler physiologischer Kochsalzung und leeren Sie die Brunnen.Fügen Sie 100 Mikroliter C.albicans Suspension zu jedem Brunnen, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten, dann waschen Sie den Brunnen dreimal mit Kochchen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum zu jedem Brunnen hinzu. Den Teller zwei Stunden lang bebrüten und dann dreimal mit Kochchen waschen.Leeren Sie die Brunnen, aber lassen Sie ein 20-Mikroliter-Reservoir, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden. Fügen Sie 100 Mikroliter S.mutans Suspension und 150 Mikroliter BHI mit 5%Saccharose zu jedem Brunnen hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden oder länger.Wenn Sie ältere Biofilme kultivieren, ersetzen Sie das Medium täglich. Am Ende der völkerübergreifenden Wachstumsphase den Teller fünfmal mit steriler physiologischer Kochsalzung waschen. Verwenden Sie für die ratiometrische pH-Bildgebung ein invertiertes konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einer 63-fachen Öl- oder Wasser-Tauchlinse, einer 543-Nanometer-Laserlinie und einem spektralen Bildgebungssystem.Verwenden Sie einen Inkubator, um die Mikroskopstufe auf 35 Grad Celsius zu erwärmen. Stellen Sie den Detektor für die gleichzeitige Detektion von grüner Fluoreszenz von 576 bis 608 Nanometern und roter Fluoreszenz von 629 bis 661 Nanometern ein. Wählen Sie dann eine geeignete Laserleistung und Verstärkung, um Über- und Unterbelichtung zu vermeiden.Stellen Sie die Lochgröße auf eine Lufteinheit oder eine optische Scheibe von etwa 0,8 Mikrometern ein. Legen Sie dann die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Scangeschwindigkeit auf zwei fest. Wählen Sie mit der Option Mittelwert einen Liniendurchschnitt von zwei aus.Bereiten Sie 100 Mikroliter steriler physiologischer Salzin mit 0,4% Glucose, die auf pH-Wert sieben titriert sind, vor. Dann machen Sie eine Lagerlösung von C-SNARF-4 und fügen Sie den Farbstoff zu einer endletzten Konzentration von 30 Mikromolar hinzu. Leeren Sie einen der Brunnen mit dem reichübergreifenden Biofilm, der ein 20-Mikroliter-Reservoir hinterlässt, und fügen Sie die Saline mit Glukose und ratiometrischem Farbstoff hinzu.Legen Sie die Platte auf die Mikroskopstufe und beginnen Sie mit der Bildgebung. Bereiten Sie eine Serie von 50 Millimolaren MES-Puffer titrated auf pH vier bis 7,8 in den Schritten von 0,2 pH-Einheiten bei 35 Grad Celsius. Pipette 150 Mikroliter jeder Pufferlösung in die Brunnen einer optischen 96-Well-Platte.Fügen Sie den Farbstoff in einer Konzentration von 30 Mikromolaren in die puffergefüllten Brunnen und lassen Sie ihn fünf Minuten auslagern. Erwärmen Sie die Mikroskopstufe auf 35 Grad Celsius, und wählen Sie die gleichen Einstellungen wie für die zuvor beschriebene ratiometrische pH-Bildgebung. Stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopbühne und konzentrieren Sie sich auf den Boden der Brunnen.Erfassen Sie grüne und rote Kanalbilder für alle Pufferlösungen. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Bilder auf, bei dem der Laser ausgeschaltet ist, um den Detektorversatz zu korrigieren. Führen Sie das Kalibrierungsexperiment in dreifacher Ausführung durch und exportieren Sie alle Bilder als TIFF-Dateien.Speichern Sie die grünen und roten Bilder in separaten Ordnern, und benennen Sie beide Dateireihen mit fortlaufenden Nummern um. Importieren Sie die Bilder in dedizierte Bildanalysesoftware wie ImageJ. Klicken Sie in den Bildern, die mit dem Laser aus aufgenommen wurden, auf Analysieren und Histogramm, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu bestimmen.Subtrahieren Sie diesen Wert von den Biofilmbildern, indem Sie auf Prozess, Mathematik und Subtrahieren klicken. Importieren Sie dann die beiden Bildserien in daime, und führen Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung der Roten Kanalbilder durch Klicken auf Segment, automatische Segmentierung und benutzerdefinierte Schwelle durch. Stellen Sie den niedrigen Schwellenwert über der Fluoreszenzintensität des Pilzzytoplasmas und den hohen Schwellenwert unterhalb der Intensität der Pilzzellwände und der Bakterien ein.Übertragen Sie dann die Objektebene der segmentierten Bildserie in die grüne Kanalbildreihe, indem Sie auf Segment und Objektebene klicken. Löschen Sie Nicht-Objektpixel in der roten und grünen Kanalserie. Nun werden die Biofilmbilder aus Bakterien- und Pilzzellen gelöscht und können als TIFF-Dateien exportiert werden.Importieren Sie die Bildserie wieder in ImageJ und teilen Sie die rote Bildserie selbst auf. Multiplizieren Sie dann das Ergebnis mit der ursprünglichen Bildreihe. Die resultierende Bildreihe ist identisch mit dem Original, außer dass alle Null-Intensitätspixel entfernt werden.Wiederholen Sie den Vorgang mit der grünen Bildserie. Verwenden Sie als Nächstes den mittleren Filter bei beiden Bildserien, um Detektorgeräusche auszugleichen. Dividieren Sie das Grün durch die rote Bildreihe, die dann das Grün-Rot-Verhältnis für alle Objektpixel ergibt.Robuste, reichübergreifende Biofilme entwickelten sich nach 24 und 48 Stunden in den Brunnenplatten. Einzelne Zellen und Ketten von S.mutans gruppiert um Pilzhyphen und große intrazelluläre Räume zeigten das Vorhandensein einer voluminösen Matrix. Der pH-Wert im extrazellulären Raum wurde mithilfe einer Nachschlagetabelle visualisiert.Der extrazelluläre pH-Wert in den Biofilmen sank in den ersten fünf Minuten nach der Glukose-Exposition schnell. Danach verlangsamte sich die Versauerung und erreichte in der Regel Werte von 5,5 bis 5,8 nach 15 Minuten. Aufgrund der lokalen pH-Änderungen änderte sich die Fluoreszenzintensität in den Biofilmen im Laufe der Zeit.Während der Bildsegmentierung wurden hohe und niedrige Schwellenwerte gewählt, um alle Bereiche, die von Bakterien- und Pilzzellen bedeckt sind, angemessen zu eliminieren. Die blauen und grünen Bereiche wurden durch die niedrigen bzw. hohen Schwellen eliminiert. Die sorgfältige Wahl der Bildaufnahmeparameter ist entscheidend, um einen guten Kontrast zwischen Bakterienzellen, Pilzzellen und der Biofilmmatrix zu erhalten.Wenn reichübergreifende Biofilme in Durchflusszellen angebaut werden, können pH-Entwicklungen unter Strömungsbedingung überwacht werden, die diejenigen in der Mundhöhle imitiert. Die pH-Ratiometrie wurde eingesetzt, um lokale Gebiete in zahnärztlichen Biofilmen mit besonders niedrigem pH-Wert, sogenannten säureogenen Hotspots, zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Forschung

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