Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
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Anette Aakjar Thomsen e Javier E. Garcia sono riconosciute per un eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano Rubens Spin-Neto per fruttuose discussioni sull'analisi delle immagini.

Il protocollo per la raccolta della saliva è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico della contea di Aarhus (M-20100032).
1. Coltivazione di Biofilm trasversali
<ol><li>Crescere S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 su piastre di agar di sangue a 37 gradi centigradi in condizioni aerobiche.</li>
	<li>Trasferire colonie singole di ogni organismo a provette piene di 5 mL di infusione del cuore cerebrale (BHI). Coltivare per 18 h in condizioni aerobiche a 37 gradi ...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Diversi protocolli per la coltivazione di biofilm tra regni che coinvolgono C. albicans e Streptococcus spp. sono stati descritti in precedenza9,22,23,24,25. Tuttavia, l'attuale configurazione si concentra su condizioni di crescita semplici, un calendario compatibile con i normali giorni lavorativi, una composizione equilibrata delle...

I biofilm tra regni incrociati che comprendono specie sia fungine che batteriche sono coinvolti in diverse condizioni patologiche nella cavità orale. Candida spp. sono stati spesso isolati da infezioni endodontiche1 e da lesioni parodontali2,3. Nelle infezioni mucosali, specie streptococcal del gruppo mitis hanno dimostrato di migliorare la formazione di biofilm fungini, l'invasione dei tessuti e la diffusione in entrambi i modelli in vitro e murini4,5,6,7. La cosa più interessante, il trasporto orale di Candida spp. è stato dimostrato di essere associato con la prevalenza di carie nei bambini8. Come mostrato nei modelli di roditori, una relazione simbiotica tra Streptococcus mutans e Candidas albicans aumenta la produzione di polisaccharides extracellulari e porta alla formazione di biofilm biogenici più spessi e cariogenici9,10.
In tutte le condizioni di cui sopra, in particolare le carie della prima infanzia, il pH del biofilm è importante per la progressione della malattia e il ruolo eminente della matrice dei biofilm per lo sviluppo di microambienti acidogenici11 richiede metodologie che consentano di studiare i cambiamenti del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati. Sono stati sviluppati approcci confocali a base di microscopia confocale semplici e accurati per monitorare il pH all'interno di biofilm batterici12 e13 fungini. Con il colorante ratiometrico C-SNARF-4 e la post-elaborazione dell'immagine basata sulla soglia, il pH extracellulare può essere determinato in tempo reale in tutte e tre le dimensioni di un biofilm14. Rispetto ad altre tecniche pubblicate per il monitoraggio del pH basato sulla microscopia nei biofilm, la pH ratiometry con C-SNARF-4 è semplice ed economica, perché non richiede la sintesi di particelle o composti che includono un colorante di riferimento15 o l'uso di eccitazione a due fotoni16. L'uso di un solo colorante previene problemi con la compartimentazione della sonda, il sanguinamento fluorescente e lo sbiancamento selettivo16,17,18 pur consentendo una differenziazione affidabile tra pH intra ed extracellulare. Infine, l'incubazione con il colorante viene eseguita dopo la crescita del biofilm, che consente di studiare sia i biofilm di laboratorio che quelli coltivati in situ.
L'obiettivo del presente lavoro è quello di estendere l'uso della pH ratiometry e fornire un metodo per studiare i cambiamenti di pH nei biofilm tra regni. Come prova di concetto, il metodo viene utilizzato per monitorare il pH in biofilm a doppia specie costituiti da S. mutans e C. albicans esposti al glucosio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

I biofilm tra regni composti da cellule fungine e batteriche sono coinvolti in una varietà di malattie orali, come infezioni endodontiche, parodontite, infezioni mucosali e, in particolare, carie della prima infanzia. In tutte queste condizioni, il pH nella matrice del biofilm influisce sulle interazioni microbo-ospite e quindi sulla progressione della malattia. Il presente protocollo descrive un metodo confocale basato sulla microscopia per monitorare le dinamiche del pH all'interno di biofilm tra regni incrociati che comprendono albicani Candida e mutans Streptococcus. Lo spettro a doppia emissione dipendente dal pH e le proprietà di colorazione della sonda ratiometrica C-SNARF-4 sono sfruttati per determinare le gocce di pH nelle aree extracellulari dei biofilm. L'uso di pH ratiometry con la sonda richiede una scelta meticolosa di parametri di imaging, una calibrazione completa del colorante e un'attenta post-elaborazione basata sulla soglia dei dati dell'immagine. Se utilizzata correttamente, la tecnica consente la valutazione rapida del pH extracellulare in diverse aree di un biofilm e quindi il monitoraggio dei gradienti di pH orizzontali e verticali nel tempo. Mentre l'uso di limiti di microscopia confocale per biofilm sottili di 75 m o meno, l'uso di pH ratiometry è ideale per lo studio non invasivo di un importante fattore di virulenza nei biofilm cross-kingdom.

Dopo 24 h e 48 h, robusti biofilm tra regni si sono sviluppati nelle piastre del pozzo. C. albicans ha mostrato vari gradi di crescita filamentosa, e S. mutans formavano ammassi densi fino a 35 m di altezza. Singole cellule e catene di S. mutans raggruppate intorno alle iphae fungine, e ampi spazi intercellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa (Figura S1).
La calibrazione del tintura ratiometrica produce una curva sigmoidale asimmetr...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all'interno di questi biofilm.

Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Il protocollo presenta un metodo di facile esecuzione per la coltivazione di biofilm cross-kingdom costituiti da StreptococcuS. mutans e Candida albicans. La successiva ratiometria del pH a base di microscopia confocale consente un monitoraggio accurato degli sviluppi del pH all'interno della matrice extracellulare di tali biofilm.L'attenta scelta dei parametri di acquisizione delle immagini è della massima importanza per ottenere dati di immagine con un contrasto sufficiente per l'analisi successiva. La ratiometria del pH è un metodo rapido, preciso ed economico per studiare sia i gradienti di pH orizzontali che verticali nei biofilm cross-kingdom in tempo reale. La ratiometria del pH può anche essere eseguita in biofilm puramente fungini e batterici.Il metodo contribuisce ad aumentare la nostra comprensione del metabolismo microbico nei biofilm. A dimostrare la procedura per la crescita del biofilm sarà Anette Aakjaer Thomsen, un tecnico del mio laboratorio. Coltivare S.mutans e C.albicans su piastre di agar del sangue a 37 gradi Celsius in condizioni aerobiche.Quindi trasferire singole colonie di ogni organismo in provette piene di cinque millilitri di infusione di cuore cerebrale e farle crescere per altre 18 ore. Il giorno dopo, centrifuga le colture a 1.200 volte g per cinque minuti e scarta il supernatante. Rimescolare le cellule in soluzione salina fisiologica e regolare l'OD 550 a 0,5 sia per i C.albicans che per gli S.mutans.Quindi diluire la sospensione S.mutans da uno a 10 per ottenere concentrazioni equivalenti. Pipetta 50 microlitri di soluzione salivare sterile nei pozzi di una piastra ottica bottom da 96 porri per microscopia. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavare la piastra tre volte con 100 microlitri di soluzione salina fisiologica sterile e svuotare i pozzi.Aggiungere 100 microlitri di sospensione C.albicans ad ogni pozzo, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 90 minuti, quindi lavare il pozzo tre volte con soluzione salina. Aggiungere quindi 100 microlitri di siero bovino fetale inattivato termicamente ad ogni pozzo. Incubare il piatto per due ore, quindi lavarlo tre volte con soluzione salina.Svuotare i pozzi ma lasciare un serbatoio da 20 microliter per evitare eccessive forze di taglio. Aggiungere 100 microlitri di sospensione S.mutans e 150 microlitri di BHI con il 5% di saccarosio ad ogni pozzo. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore o più.Quando si coltivano biofilm più vecchi, sostituire il mezzo ogni giorno. Al termine della fase di crescita cross-kingdom, lavare il piatto cinque volte con soluzione salina fisiologica sterile. Per l'imaging pH ratiometrico, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertito con una lente ad immersione in olio o acqua 63X, una linea laser da 543 nanometri e un sistema di imaging spettrale.Utilizzare un incubatore per riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi Celsius. Impostare il rilevatore per il rilevamento simultaneo della fluorescenza verde da 576 a 608 nanometri e della fluorescenza rossa da 629 a 661 nanometri. Quindi scegli una potenza e un guadagno laser appropriati per evitare sovraesposizione e sottoesposizione.Impostare le dimensioni del foro stenopeica su un'unità d'aria o una fetta ottica di circa 0,8 micrometri. Quindi impostare le dimensioni dell'immagine su 512 per 512 pixel e la velocità di scansione su due. Scegli una media di linea di due usando l'opzione media.Preparare 100 microlitri di soluzione salina fisiologica sterile con 0,4% di glucosio titolazione a pH sette. Quindi fare una soluzione stock di C-SNARF-4 e aggiungere il colorante a una concentrazione finale di 30 micromolare. Svuotare uno dei pozzi con il biofilm cross-kingdom lasciando un serbatoio di 20 microliter e aggiungere la salina con glucosio e colorante ratiometrico.Posizionare la piastra sullo stadio del microscopio e iniziare l'imaging. Preparare una serie di tampone MES da 50 millimolare titolazione a pH da quattro a 7,8 negli incrementi di 0,2 unità di pH a 35 gradi Celsius. Pipetta 150 microlitri di ogni soluzione tampone nei pozzi di una piastra ottica inferiore da 96 pozzi.Aggiungere il colorante ai pozzali riempiti tampone ad una concentrazione di 30 micromolari e lasciarlo equilibrare per cinque minuti. Riscaldare lo stadio del microscopio a 35 gradi Celsius e scegliere le stesse impostazioni dell'imaging pH ratiometrico descritto in precedenza. Posizionare la piastra da 96 punti sullo stadio del microscopio e concentrarsi sul fondo dei pozzi.Acquisire immagini di canali verdi e rossi per tutte le soluzioni buffer. A intervalli regolari, scatta immagini con il laser spento per correggere l'offset del rilevatore. Eseguire l'esperimento di calibrazione in triplice copia ed esportare tutte le immagini come file TIFF.Archiviare le immagini verdi e rosse in cartelle separate e rinominare entrambe le serie di file con numeri sequenziali. Importare le immagini in software di analisi delle immagini dedicato come ImageJ. Nelle immagini scattate con il laser spento, fare clic su analisi e istogramma per determinare l'intensità media della fluorescenza.Sottrarre questo valore dalle immagini del biofilm facendo clic su processo, matematica e sottrazione. Quindi importare le due serie di immagini in daime ed eseguire una segmentazione basata sulla soglia delle immagini del canale rosso facendo clic sul segmento, sulla segmentazione automatica e sulla soglia personalizzata. Impostare la soglia bassa al di sopra dell'intensità di fluorescenza del citoplasma fungino e la soglia elevata al di sotto dell'intensità delle pareti cellulari fungine e dei batteri.Quindi trasferire il livello oggetto della serie di immagini segmentate nella serie di immagini del canale verde facendo clic sul segmento e sul livello dell'oggetto di trasferimento. Eliminare i pixel non oggetto nella serie di canali rosso e verde. Ora le immagini del biofilm sono cancellate da cellule batteriche e fungine e possono essere esportate come file TIFF.Importate di nuovo la serie di immagini in ImageJ e dividete la serie di immagini rosse da sola. Quindi moltiplicare il risultato per la serie di immagini originale. La serie di immagini risultante è identica all'originale, tranne per il fatto che tutti i pixel a intensità zero vengono rimossi.Ripetere il processo con la serie di immagini verdi. Quindi, utilizzare il filtro medio su entrambe le serie di immagini per compensare il rumore del rilevatore. Dividi il verde per la serie di immagini rosse che quindi produce il rapporto verde-rosso per tutti i pixel degli oggetti.Robusti biofilm cross-kingdom sviluppati nelle piastre del pozzo dopo 24 e 48 ore. Singole cellule e catene di S.mutans raggruppate attorno a ife fungine e grandi spazi intracellulari indicavano la presenza di una matrice voluminosa. Il pH nello spazio extracellulare è stato visualizzato utilizzando una tabella di ricerca.Il pH extracellulare nei biofilm è diminuito rapidamente nei primi cinque minuti dopo l'esposizione al glucosio. Successivamente, l'acidificazione ha rallentato raggiungendo in genere valori da 5,5 a 5,8 dopo 15 minuti. A causa dei cambiamenti di pH locali, l'intensità della fluorescenza nei biofilm è cambiata nel tempo.Durante la segmentazione delle immagini, sono state scelte soglie alte e basse per eliminare adeguatamente tutte le aree coperte da cellule batteriche e fungine. Le aree blu e verdi sono state eliminate rispettivamente dalle soglie basse e alte. L'attenta scelta dei parametri di acquisizione delle immagini è fondamentale per ottenere un buon contrasto tra cellule batteriche, cellule fungine e matrice di biofilm.Se i biofilm cross-kingdom vengono coltivati in cellule di flusso, gli sviluppi del pH possono essere monitorati in condizioni di flusso imitando quelli nella cavità orale. La ratiometria del pH è stata utilizzata per identificare le aree locali nei biofilm dentali con pH particolarmente basso, i cosiddetti hotspot acidogenici.

Research

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