Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
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아네트 아크예르 톰슨과 하비에르 E. 가르시아는 뛰어난 기술 지원을 인정받고 있습니다. 저자는 이미지 분석에 대한 유익한 토론에 대한 루벤스 스핀 네토 감사.

타액 수집프로토콜은 오르후스 카운티 윤리위원회(M-20100032)에 의해 검토및 승인되었습니다.
1. 크로스 킹덤 바이오필름 재배
<ol><li>S. 뮤탄스 DSM 20523 및 C. 알비칸스 NCPF 3179를 에어로빅 조건하에서 37°C에서 혈액 한천 플레이트에 성장시다.</li>
	<li>각 유기체의 단일 식민지를 뇌 심장 주입 (BHI)의 5 mL로 채워진 시험관으로 옮니다. 37 °C에서 에어로빅 조건하에서 18...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

C. 알비칸스 및 연쇄상 구균 spp를 포함하는 크로스 킹클크로스 킹에 대한 상이한 프로토콜은 이전에9,22,23,24,25를기술되었다. 그러나, 현재설정은 단순 성장 조건, 정규 근무일과 호환되는 시간 일정, 균형 잡힌 종 조성 및 방대한 생물막 매트릭스 의 개발?...

곰팡이와 세균성 종을 모두 포함하는 크로스 킹덤 생물막은 구강내 여러 병리학 적 조건에 관여합니다. 칸디다 spp. 빈번 하 게 에서 분리 된 endodontic 감염1 그리고 치 주 변 병 변에서2,3. 점막 감염에서, 기염 단에서 연쇄상 구균 종은 시험관 내 및 murine 모형4,5,6,7둘 다에 있는 곰팡이 생물막 대형, 조직 침략 및 보급을 강화하기 위하여 보였습니다. 가장 흥미롭게도, 칸디다 종의 구강 마차는어린이8에서 우식증의 보급과 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 설치류 모델에서 도시된 바와 같이, 연쇄상 구균 뮤탄스와 칸디다스 알비칸스 사이의 공생 관계는 세포외 다당류의 생산을 증가시키고 더 두껍고 더 많은 카리오제닉 생물막의 형성을 이끈다,10.
위에서 언급한 모든 조건에서, 특히, 생물막 pH는 질병 진행에 매우 중요하며, 산성미세환경(11)의 개발을 위한 생물막 매트릭스의 탁월한 역할은 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 변화를 연구할 수 있는 방법론을 요구한다. 세균12 및 곰팡이13 생물막 내부의 pH를 모니터링하는 간단하고 정확한 공초점 현미경 기반 접근법이 개발되었습니다. 비측정 염료 C-SNARF-4 및 임계값 기반 이미지 후처리를 통해, 세포외 pH는생물막(14)의모든 3차원에서 실시간으로 결정될 수 있다. 생물막에서 현미경 기반 pH 모니터링을 위한 다른 공표된 기술에 비해, C-SNARF-4를 사용한 pH 비측정법은 기준염료(15) 또는 2광자인용(16)의사용을 포함하는 입자 또는 화합물의 합성을 필요로 하지 않기 때문에 간단하고 저렴하다. 단 하나의 염료를 사용하면 프로브 구획화, 형광 피,선택적 표백16,17,18의 문제를 방지하면서 세포 내 pH와 세포 외 pH 간의 신뢰할 수있는 분화를 허용합니다. 마지막으로, 염료를 가진 배양은 실험실과 그(것)들 성장한 생물막에서 둘 다 공부하는 것을 허용하는 생물막 성장 후에 행해줍니다.
본 연구의 목적은 pH 비측정법의 사용을 확장하고 왕국 간 생물막에서 pH 변화를 연구하는 방법을 제공하는 것이다. 개념의 증거로서, 이 방법은 포도당에 노출된 S. 뮤탄및 C. 알비칸스로 구성된 이중 종 생물막에서 pH를 모니터링하는 데 사용된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

곰팡이 와 세균성 세포로 구성된 크로스 킹덤 생물막은 엔도돈증 감염, 치주염, 점막 감염 및 특히 어린 시절 충치와 같은 다양한 구강 질환에 관여합니다. 이러한 모든 조건에서, 생물막 매트릭스내의 pH는 미생물-숙주 상호작용 및 따라서 질병 진행에 영향을 미친다. 본 프로토콜은 칸디다 알비칸스 및 연쇄상 구균 뮤탄을 포함하는 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 역학을 모니터링하는 공초점 현미경 기반 방법을 기술한다. pH 의존적 이중 방출 스펙트럼 및 비메트릭 프로브 C-SNARF-4의 염색 특성은 생물막의 세포외 영역에서 pH의 하락을 결정하기 위해 이용된다. 프로브와 pH 비율 측정을 사용하려면 이미징 매개 변수의 세심한 선택, 염료의 철저한 교정, 이미지 데이터의 신중한 임계값 기반 사후 처리가 필요합니다. 올바르게 사용될 때, 기술은 생물막의 다른 지역에 있는 세포외 pH의 급속한 평가를 허용하고 따라서 시간 지남에 따라 수평 및 수직 pH 구배 둘 다의 감시를 허용합니다. 공초점 현미경 검사법의 사용은 Z 프로파일링을 75 μm 이하의 얇은 바이오필름으로 제한하지만, pH 비율 측정법의 사용은 왕국 간 생물막에서 중요한 독성 계수의 비침습적 연구에 이상적입니다.

24 시간 및 48 시간 후, 우물 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. C. albicans는 필라멘트 성장의 다양한 정도를 보여주었고, S. 뮤탄은 높이가 최대 35 μm의 조밀 한 클러스터를 형성했습니다. 단일 세포 및 S. 뮤탄의 사슬은 곰팡이 하이페 주위에 그룹화되고, 큰 세포 간 공간은 볼륨감 있는 매트릭스의 존재를 나타냈다(도S1).
비대칭 ?...

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Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.

공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

이 프로토콜은 연쇄상 구균으로 구성된 크로스 킹덤 생물막의 재배를위한 수행하기 쉬운 방법을 제시한다. 뮤탄과 칸디다 알비칸스. 후속 공초점 현미경 기반 pH 비율측정은 그 생물막의 세포외 매트릭스 내부의 pH 발달의 정확한 모니터링을 허용합니다.이미지 수집 매개 변수의 신중한 선택은 후속 분석을 위한 충분한 대비를 가진 이미지 데이터를 얻는 것이 가장 중요합니다. pH 비율측정법은 크로스 킹덤 생물막에서 수평 및 수직 pH 그라데이션을 실시간으로 연구하는 신속하고 정밀하며 저렴한 방법입니다. pH 비율 측정은 또한 순전히 곰팡이 및 세균성 생물막에서 수행 될 수있다.이 방법은 생물막에서 미생물 대사에 대한 이해를 높이는 데 기여합니다. 생물막 성장 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 아네트 아크하에르 톰슨 (Anette Aakjaer Thomsen)이 될 것입니다. 호기성 조건하에서 섭씨 37도에서 혈액 천막 접시에 S.mutans와 C.albicans를 성장.그런 다음 각 유기체의 단일 식민지를 옮겨 뇌 심장 주입의 5 밀리리터로 채워진 튜브를 테스트하고 추가로 18 시간 동안 재배합니다. 다음 날, 원심분리기는 5분간 1, 200배 g로 문화를 폐기하고 상복부을 폐기한다. 생리식염수에 세포를 다시 중단하고 C.albicans 및 S.mutans 둘 다에 대한 OD 550에서 0.5를 조정합니다.그런 다음 S.mutans 현탁액을 1 대 10으로 희석하여 동등한 농도를 달성합니다. 피펫 50 마이크로리터의 멸균 침액용액은 현미경 검사를 위한 광학 하단 96웰 플레이트의 우물에 들어갑니다. 37°C에서 30분 동안 접시를 배양한 다음, 멸균 생리식염수 100마이크로리터로 접시를 세 번 씻고 우물을 비웁습니다.C.albicans 서스펜션 100마이크로리터를 각 웰에 넣고, 90분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한 다음 식염수로 잘 세 번 씻습니다. 다음으로, 각 우물에 열 비활성화 태아 소 혈청 100 마이크로 리터를 추가합니다. 접시를 2시간 동안 배양한 다음 식염수로 세 번 씻습니다.우물을 비우지만 과도한 전단력을 피하기 위해 20 마이크로리터 저장소를 둡니다. S.mutans 서스펜션 100마이크로리터와 BHI 150마이크로리터를 각각 5%의 자당에 추가합니다. 그런 다음 24 시간 이상 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.오래된 생물막을 재배할 때는 매일 매체를 교체하십시오. 크로스 킹덤 성장 단계의 끝에서, 멸균 생리식염수로 접시를 5 번 세척하십시오. 비메트릭 pH 이미징의 경우 63X 오일 또는 수분 침수 렌즈, 543 나노미터 레이저 라인 및 스펙트럼 이미징 시스템을 갖춘 반전된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하십시오.인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 섭씨 35도까지 데워보겠습니다. 녹색 형광의 동시 검출을 위해 검출기를 설정 576 받는 사람의 608 나노 미터 와 적색 형광 629 받는 르 661 나노 미터. 그런 다음 적절한 레이저 전원을 선택하고 과다 노출을 피하기 위해 이득을 얻습니다.핀홀 크기를 하나의 공기 장치 또는 약 0.8 마이크로미터의 광학 조각으로 설정합니다. 그런 다음 이미지 크기를 512x512픽셀로 설정하고 스캔 속도를 2개로 설정합니다. 평균 옵션을 사용하여 2개의 줄 평균을 선택합니다.pH 7에 적정된 0.4%의 포도당으로 멸균 생리식염수 100마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 C-SNARF-4의 스톡 용액을 만들고 염료를 30 마이크로몰라의 최종 농도에 추가합니다. 20 마이크로 리터 저수지를 떠나 크로스 킹덤 생물 막우물 중 하나를 비우고 포도당과 비율 염료와 식염수를 추가합니다.현미경 단계에 접시를 놓고 이미징을 시작합니다. 섭씨 35도에서 0.2 pH 단위로 pH 4 ~ 7.8로 적정된 50 밀리머 MES 버퍼 시리즈를 준비한다. 파이펫 150 마이크로리터의 각 버퍼 용액을 광학 하단 96웰 플레이트의 우물에 넣습니다.30 마이크로몰러의 농도에서 완충로 채워진 우물에 염료를 추가하고 5 분 동안 평형하게합니다. 현미경 단계를 섭씨 35도로 따뜻하게 하고 이전에 설명한 비율 측정 pH 이미징과 동일한 설정을 선택합니다. 현미경 단계에 96 웰 플레이트를 놓고 우물바닥에 집중하십시오.모든 버퍼 솔루션에 대한 녹색 및 빨간색 채널 이미지를 획득합니다. 정기적으로 레이저를 끄고 이미지를 사용하여 검출기 오프셋을 보정합니다. 트리플리케이트에서 교정 실험을 수행하고 모든 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다.녹색과 빨간색 이미지를 별도의 폴더에 저장하고 순차번호가 있는 두 파일 의 이름을 변경합니다. ImageJ와 같은 전용 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 가져옵니다. 레이저 끄기로 촬영한 이미지에서 분석 및 히스토그램을 클릭하여 평균 형광 강도를 결정합니다.프로세스, 수학 및 빼기제거를 클릭하여 생물막 이미지에서 이 값을 뺍니다. 그런 다음 두 이미지 시리즈를 다임으로 가져오고 세그먼트, 자동 세분화 및 사용자 지정 임계값을 클릭하여 빨간색 채널 이미지의 임계값 기반 세분화를 수행합니다. 곰팡이 세포벽과 박테리아의 강도 보다 낮은 임계값을 곰팡이 세포질의 형광 강도 와 높은 임계값보다 높게 설정합니다.그런 다음 세그먼트이미지 시리즈의 오브젝트 레이어를 세그먼트를 클릭하고 개체 레이어를 전송하여 녹색 채널 이미지 시리즈로 옮김합니다. 빨간색 및 녹색 채널 시리즈에서 개체가 아닌 픽셀을 삭제합니다. 이제 생물막 이미지는 세균 및 곰팡이 세포에서 제거되고 TIFF 파일로 내보낼 수 있습니다.이미지 시리즈를 ImageJ로 다시 가져오고 빨간색 이미지 시리즈를 그 자체로 나눕니다. 그런 다음 원본 이미지 계열에서 결과를 곱합니다. 생성된 이미지 계열은 모든 0 강도 픽셀이 제거되는 것을 제외하고는 원본과 동일합니다.녹색 이미지 계열로 프로세스를 반복합니다. 다음으로 두 이미지 계열의 평균 필터를 사용하여 검출기 노이즈를 보정합니다. 녹색을 빨간색 이미지 계열로 나눈 다음 모든 오브젝트 픽셀에 대한 녹색 대 빨간색 비율을 생성합니다.24 시간 48 시간 후에 웰 플레이트에서 개발 된 견고한 크로스 킹덤 생물막. 곰팡이 최해 와 큰 세포 내 공간 주위에 그룹화 된 S.mutans의 단일 세포 및 체인은 방대한 매트릭스의 존재를 나타냈다. 세포외 공간의 pH는 조회 테이블을 사용하여 시각화되었다.생물막의 세포 외 pH는 포도당에 노출 된 후 처음 5 분 만에 빠르게 떨어졌습니다. 그 후, 산성화는 15분 후에 일반적으로 5.5에서 5.8의 값에 도달하는 것을 둔화시켰다. 국소 pH 변화로 인해 생물막의 형광 강도는 시간이 지남에 따라 변경되었습니다.이미지 세분화 하는 동안, 높고 낮은 임계값 적절 하 게 세균 및 곰 팡이 세포에 의해 덮여 모든 영역을 제거 하기 위해 선택 되었다. 파란색과 녹색 영역은 각각 낮고 높은 임계값에 의해 제거되었습니다. 이미지 획득 파라미터의 신중한 선택은 세균 세포, 곰팡이 세포 및 생물막 매트릭스 사이의 좋은 대비를 얻는 데 중요합니다.크로스 킹덤 생물막이 유량 세포에서 재배되는 경우, pH 개발은 구강 내 생물을 모방하는 유동 조건하에서 모니터링될 수 있다. pH 비율 측정은 특히 낮은 pH를 가진 치과 생물막의 지역 지역을 식별하기 위하여 채택되었습니다, 소위 산성 핫스팟.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...