Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Anette Aakjær Thomsen og Javier E. Garcia er anerkjent for utmerket teknisk støtte. Forfatterne takker Rubens Spin-Neto for fruktbare diskusjoner om bildeanalyse.

Protokollen for spyttsamling ble gjennomgått og godkjent av Etikkkomiteen i Aarhus Fylke (M-20100032).
1. Dyrking av cross-kingdom biofilmer
<ol><li>Vokse S. mutans DSM 20523 og C. albicans NCPF 3179 på blod agar plater ved 37 ° C under aerobe forhold.</li>
	<li>Overfør enkeltkolonier av hver organisme for å reagensrør fylt med 5 ml hjernehjerteinfusjon (BHI). Vokse i 18 timer under aerobe forhold ved 37 °C.</li>
	<li>Sentrifuge over natten kulturer på 1200 x g<...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Ulike protokoller for dyrking av cross-kingdom biofilms som involverer C. albicans og Streptococcus spp. har blitt beskrevet tidligere9,22,23,24,25. Det nåværende oppsettet fokuserer imidlertid på enkle vekstforhold, en tidsplan som er kompatibel med vanlige arbeidsdager, en balansert artssammensetning og utviklingen av en volumin...

Cross-kingdom biofilmer bestående av både sopp og bakterielle arter er involvert i flere patologiske forhold i munnhulen. Candida spp. har ofte blitt isolert fra endodontiske infeksjoner1 og fra periodontal lesjoner2,3. I slimhinneinfeksjoner har streptokokkarter fra mitisgruppen vist seg å forbedre soppbiofilmdannelse, vevsinvasjon og formidling i både in vitro- og murinemodeller4,5,6,7. Mest interessant, muntlig transport av Candida spp. har vist seg å være forbundet med utbredelsen av karies hos barn8. Som vist i gnagermodeller, øker et symbiotisk forhold mellom Streptococcus mutans og Candidas albicans produksjonen av ekstracellulære polysakkarider og fører til dannelse av tykkere og mer kariogene biofilmer9,10.
I alle de ovennevnte forholdene, tidlig barndom karies spesielt, biofilm pH er av betydning for sykdomsprogresjon, og den eminente rollen biofilm matrise for utvikling av acidogenic mikromiljøer11 krever metoder som tillater å studere pH endringer i kryss-rike biofilmer. Enkle og nøyaktige konfokale mikroskopibaserte tilnærminger for å overvåke pH ibakterielle 12 og sopp13 biofilmer er utviklet. Med ratiometrisk e-størrelses-dye C-SNARF-4 og terskelbasert bildeetterbehandling, kan ekstracellulær pH bestemmes i sanntid i alle tre dimensjoner av en biofilm14. Sammenlignet med andre publiserte teknikker for mikroskopibasert pH-overvåking i biofilmer, er pH ratiometri med C-SNARF-4 enkel og billig, fordi det ikke krever syntese av partikler eller forbindelser som inkluderer et referansefarge15 eller bruk av tofotær eksitasjon16. Bruk av bare ett farge forhindrer problemer med probe compartmentalization, fluorescerende blødning, og selektiv bleking16,17,18 samtidig som det muliggjør en pålitelig differensiering mellom intra- og ekstracellulær pH. Til slutt utføres inkubasjon med dye etter biofilmvekst, noe som gjør det mulig å studere både laboratorium og in situ-dyrkede biofilmer.
Målet med det nåværende arbeidet er å utvide bruken av pH ratiometri og gi en metode for å studere pH-endringer i kryssrike biofilmer. Som konseptbevis brukes metoden til å overvåke pH i biofilmer med to arter bestående av S. fåredyr og C. albikaner eksponert for glukose.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Cross-kingdom biofilmer bestående av både sopp og bakterielle celler er involvert i en rekke orale sykdommer, som endodontiske infeksjoner, periodontitt, slimhinneinfeksjoner og, spesielt, tidlig barndom karies. Under alle disse forholdene påvirker pH i biofilmmatrisen mikrobevertinteraksjoner og dermed sykdomsprogresjonen. Den nåværende protokollen beskriver en konfokal mikroskopibasert metode for å overvåke pH-dynamikk i kryssrike biofilmer bestående av Candida albicans og Streptococcus mutans. Det pH-avhengige dual-utslippsspekteret og fargeegenskapene til den metriske sonden C-SNARF-4 utnyttes for å bestemme dråper i pH i ekstracellulære områder av biofilmene. Bruk av pH-ratiometri med sonden krever et omhyggelig valg av bildeparametere, en grundig kalibrering av farsen og forsiktig, terskelbasert etterbehandling av bildedataene. Når den brukes riktig, gjør teknikken for rask vurdering av ekstracellulær pH i forskjellige områder av en biofilm og dermed overvåking av både horisontale og vertikale pH gradienter over tid. Mens bruken av konfokal mikroskopi begrenser Z-profilering til tynne biofilmer på 75 μm eller mindre, er bruken av pH ratiometri ideelt egnet for den ikke-invasive studien av en viktig virulensfaktor i biofilmer på tvers av rike.

Etter 24 timer og 48 timer utviklet robuste biofilmer på tvers av kongedømmene i brønnplatene. C. albicans viste varierende grad av filamentous vekst, og S. fårekjøtt dannet tette klynger på opptil 35 μm i høyden. Enkeltceller og kjeder av S. fårekjøtt gruppert rundt sopphyphae, og store intercellulære mellomrom indikerte tilstedeværelsen av en voluminøs matrise (Figur S1).
Kalibrering av det ratiometriske farge gir en asymmetrisk sigmoi...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Protokollen beskriver dyrking av cross-kingdom biofilmer bestående av Candida albicans og Streptococcus mutans og presenterer en konfokal mikroskopibasert metode for overvåking av ekstracellulær pH inne i disse biofilmene.

Overvåking ekstracellulær pH i Cross-Kingdom Biofilms ved hjelp av Confocal Microscopy

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Protokollen presenterer en lett-å-utføre metode for dyrking av kryssrike biofilmer bestående av StreptococcuS. mutans og Candida albicans. Påfølgende konfokal mikroskopibasert pH-ratiometri gir nøyaktig overvåking av pH-utviklingen inne i den ekstracellulære matrisen til disse biofilmene.Det nøye valget av bildeanskaffelsesparametere er av største betydning for å innhente bildedata med tilstrekkelig kontrast for etterfølgende analyse. pH ratiometri er en rask, presis og billig metode for å studere både horisontale og vertikale pH-graderinger i biofilmer på tvers av rike i sanntid. pH-ratiometri kan også utføres i rent sopp- og bakteriebiofilmer.Metoden bidrar til å øke vår forståelse av mikrobiell metabolisme i biofilmer. Viser prosedyren for biofilmvekst vil være Anette Aakjaer Thomsen, en tekniker fra laboratoriet mitt. Grow S.mutans og C.albicans på blod agar plater på 37 grader Celsius under aerobe forhold.Overfør deretter enkeltkolonier av hver organisme til testrør fylt med fem milliliter hjernehjerteinfusjon og dyrke dem i ytterligere 18 timer. På neste dag sentrifuger kulturene på 1, 200 ganger g i fem minutter og kast det overnaturlige. Resuspend cellene i fysiologisk saltvann og justere OD 550 til 0,5 for både C.albicans og S.mutans.Deretter fortynne s.mutans suspensjon en til 10 for å oppnå tilsvarende konsentrasjoner. Pipette 50 mikroliter sterile spyttoppløsning i brønnene på en optisk bunn 96-brønnplate for mikroskopi. Inkuber platen i 30 minutter ved 37 grader Celsius, vask deretter platen tre ganger med 100 mikroliter steril fysiologisk saltvann og tøm brønnene.Tilsett 100 mikroliter C.albicans suspensjon til hver brønn, inkuber platen ved 37 grader Celsius i 90 minutter, vask deretter brønnen tre ganger med saltvann. Deretter legger du til 100 mikroliter varmeaktivert fostervinserum til hver brønn. Inkuber platen i to timer, og vask den deretter tre ganger med saltvann.Tøm brønnene, men la et 20 mikroliterreservoar for å unngå store skjærkrefter. Tilsett 100 mikroliter S.mutans suspensjon og 150 mikroliter BHI med 5% sukrose til hver brønn. Deretter inkubere platen ved 37 grader Celsius i 24 timer eller lenger.Når du dyrker eldre biofilmer, erstatt mediet daglig. På slutten av vekstfasen på tvers av riket, vask platen fem ganger med steril fysiologisk saltvann. For rasjoneringsmessig pH-bildebehandling, bruk et omvendt konfokal laserskanningsmikroskop med en 63X olje- eller vannsenkingslinse, en laserlinje på 543 nanometer og et spektralbildesystem.Bruk en inkubator til å varme mikroskopstadiet til 35 grader Celsius. Still inn detektoren for samtidig påvisning av grønn fluorescens fra 576 til 608 nanometer og rød fluorescens fra 629 til 661 nanometer. Velg deretter en passende laserkraft og gevinst for å unngå over og undereksponering.Sett pinholestørrelsen på en luftenhet eller en optisk skive på ca. 0,8 mikrometer. Sett deretter bildestørrelsen til 512 med 512 piksler og skannehastigheten til to. Velg et linjegjennomsnitt på to ved hjelp av gjennomsnittsalternativet.Forbered 100 mikroliter steril fysiologisk saltvann med 0,4% glukose titrert til pH syv. Lag deretter en lagerløsning av C-SNARF-4 og tilsett fargestoffet til en endelig konsentrasjon på 30 mikromos. Tøm en av brønnene med tverrriket biofilm forlater en 20 mikroliter reservoar og tilsett saltvann med glukose og rasjonell fargestoff.Plasser platen på mikroskopet og begynn å bilde. Forbered en serie på 50 millimolar MES-buffer titrert til pH fire til 7,8 i trinn på 0,2 pH-enheter ved 35 grader Celsius. Pipette 150 mikroliter av hver bufferløsning inn i brønnene på en optisk bunn 96-brønnsplate.Tilsett fargestoffet til de bufferfylte brønnene i en konsentrasjon på 30 mikromos og la det likevekt i fem minutter. Varm mikroskopet til 35 grader Celsius og velg de samme innstillingene som for rasjonell pH-bildebehandling som tidligere er beskrevet. Plasser 96-brønnsplaten på mikroskopstadiet og fokuser på bunnen av brønnene.Hent grønne og røde kanalbilder for alle bufferløsninger. Med jevne mellomrom tar du bilder med laseren slått av for å korrigere for detektorforskyvning. Utfør kalibreringseksperimentet i triplikate og eksporter alle bilder som TIFF-filer.Lagre de grønne og røde bildene i separate mapper og gi nytt navn til begge seriene med sekvensielle tall. Importer bildene til dedikert bildeanalyseprogramvare som ImageJ. I bildene tatt med laseren av, klikk analyser og histogrammet for å bestemme gjennomsnittlig fluorescensintensitet.Trekk denne verdien fra biofilmbildene ved å klikke prosess, matematikk og trekke fra. Importer deretter de to bildeseriene til daime og utfør en terskelbasert segmentering av bildene på den røde kanalen ved å klikke segment, automatisk segmentering og egendefinert terskel. Sett den lave terskelen over fluorescensintensiteten til soppcytoplasma og den høye terskelen under intensiteten av soppcelleveggene og bakteriene.Overfør deretter objektlaget i den segmenterte bildeserien til den grønne kanalbildeserien ved å klikke segment og overføre objektlag. Slett ikke-objektpiksler i den røde og grønne kanalserien. Nå er biofilmbildene fjernet fra bakterielle og soppceller og kan eksporteres som TIFF-filer.Importer bildeserien tilbake til ImageJ og del den røde bildeserien av seg selv. Deretter multipliserer du resultatet med den opprinnelige bildeserien. Den resulterende bildeserien er identisk med originalen, bortsett fra at alle nullintensitetspiksler fjernes.Gjenta prosessen med den grønne bildeserien. Deretter bruker du gjennomsnittsfilteret på begge bildeseriene for å kompensere for detektorstøy. Del greenen med den røde bildeserien som deretter gir det grønne-til-røde-forholdet for alle objektpiksler.Robuste tverrrikende biofilmer utviklet i brønnplatene etter 24 og 48 timer. Enkeltceller og kjeder av S.mutans gruppert rundt sopphyphae og store intracellulære mellomrom indikerte tilstedeværelsen av en voluminøs matrise. PH-en i det ekstracellulære rommet ble visualisert ved hjelp av en oppslagstabell.Den ekstracellulære pH i biofilmene falt raskt i de første fem minuttene etter eksponering for glukose. Deretter bremset forsuringen vanligvis å nå verdier på 5,5 til 5,8 etter 15 minutter. På grunn av de lokale pH-endringene endret fluorescensintensiteten i biofilmene seg over tid.Under bildesegmentering ble høye og lave terskler valgt for å eliminere alle områder som dekkes av bakterielle og soppceller tilstrekkelig. De blå og grønne områdene ble eliminert av henholdsvis lave og høye terskler. Det forsiktige valget av bildeoppkjøpsparametere er avgjørende for å oppnå en god kontrast mellom bakterielle celler, soppceller og biofilmmatrisen.Hvis tverrriket biofilmer dyrkes i strømningsceller, kan pH-utviklingen overvåkes under strømningstilstand som etterligner de i munnhulen. pH ratiometri har vært ansatt for å identifisere lokale områder i tannbiofilmer med spesielt lav pH, såkalte surogene hotspots.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Måling Phagosome pH ved Proporsjonellekspansjon Fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Proporsjonal Imaging av ekstracellulær pH ​​i Dental Biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...