Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Анетт Акьяр Томсен и Хавьер Э. Гарсия признаны за отличную техническую поддержку. Авторы благодарят Рубенса Спин-Нето за плодотворные дискуссии по анализу изображений.

Протокол по сбору слюны был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике округа Орхус (M-20100032).
1. Культивирование кросс-царства Biofilms
<ol><li>Выращивайте S. mutans DSM 20523 и C. albicans NCPF 3179 на табличек агара крови при 37 градусах Цельсия в аэробных условиях.</li>
	<li>Перенос отдельных к...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Различные протоколы для выращивания кросс-царства биопленок с участием C. Albicans и Streptococcus spp. были описаны ранее9,22,23,24,25. Тем не менее, нынешняя установка фокусируется на простых условия...

Кросс-царство биопленки, состоящие как грибковых и бактериальных видов участвуют в нескольких патологических условиях в полости рта. Candida spp. часто были изолированы от эндодонтических инфекций1 и от пародонта поражений2,3. В слизистых инфекций, стрептококковых видов из группы мит, были показаны для повышения грибковой биопленки формирования, ткани вторжения, и распространение в обоих в пробирке и морин модели4,5,6,7. Самое интересное, устные перевозки Candida spp. было доказано, что связано с распространенностью кариеса у детей8. Как показано в моделях грызунов, симбиотические отношения между Streptococcus mutans и Candidas albicans увеличивают выработку внеклеточных полисахаридов и приводят к образованию более толстых и кариогенных биопленок9,10.
Во всех вышеупомянутых условиях, раннего детства кариеса, в частности, биопленка рН имеет важное значение для прогрессирования заболевания, и выдающаяся роль биопленки матрицы для развития ацидогенной микросреды11 требует методологии, которые позволяют изучать изменения рН внутри кросс-царства биопленки. Были разработаны простые и точные подходы на основе конфокальной микроскопии для мониторинга рН внутри бактериальных12 и грибковых13 биопленок. С соотношением метрического красителя C-SNARF-4 и пороговым изображением после обработки, внеклеточный рН может быть определен в режиме реального времени во всех трех измерениях биопленки14. По сравнению с другими опубликованными методами для микроскопии на основе рН-мониторинга в биопленках, рН коэффициентеметрия с C-SNARF-4 проста и дешева, потому что она не требует синтеза частиц или соединений, которые включают эталонный краситель15 или использование двухфотонных возбуждения16. Использование только одного красителя предотвращает проблемы с разобщенностью зонда, флуоресцентным кровотечениемчерез,и селективное отбеливание 16,17,18 в то же время позволяет надежной дифференциации между внутри- и внеклеточного рН. Наконец, инкубация красителя осуществляется после роста биопленки, что позволяет изучать как лабораторные, так и на месте выращенные биопленки.
Целью настоящей работы является расширение использования коэффициента рН и предоставление метода изучения изменений рН в биопленках кросс-царства. В качестве доказательства концепции, метод используется для мониторинга рН в биопленки двойного вида, состоящий из S. mutans и C. albicans подвергаются воздействию глюкозы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Кросс-царство биопленки, состоящие из грибковых и бактериальных клеток участвуют в различных заболеваний полости рта, таких как эндодонтические инфекции, пародонтит, слизистой инфекции и, прежде всего, раннего детства кариеса. Во всех этих условиях рН в матрице биопленки воздействует на взаимодействие микробов-хозяина и, таким образом, прогрессирование болезни. Настоящий протокол описывает конфокальный метод на основе микроскопии для мониторинга динамики рН внутри кросс-царства биопленок, включая Candida Albicans и Streptococcus mutans. РН-зависимый спектр двойного излучения и окрашивающие свойства социеметрического зонда C-SNARF-4 используются для определения капель рН во внеклеточных областях биопленок. Использование коэффициента рН с зондом требует тщательного выбора параметров изображения, тщательной калибровки красителя и осторожной, пороговой постобработки данных изображения. При правильном использовании метод позволяет быстро оценивать внеклеточный рН в различных областях биопленки и, таким образом, мониторинг как горизонтальных, так и вертикальных градиентов рН с течением времени. В то время как использование конфокальной микроскопии ограничивает профилирование до тонких биопленок размером 75 мкм или менее, использование коэффициента рН идеально подходит для неинвазивного изучения важного фактора вирулентности в биопленках кросс-царства.

После 24 ч и 48 ч, надежные кросс-царства биопленки разработаны в колодце пластин. C. albicans показал различную степень нитевидного роста, а S. mutans образуют плотные скопления высотой до 35 мкм. Одиночные клетки и цепи S. mutans сгруппированы вокруг грибковых гиф, и большие межклеточны?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Протокол описывает выращивание кросс-царства биопленок, состоящий из Candida Albicans и Streptococcus mutans и представляет конфокальную микроскопию на основе метода для мониторинга внеклеточного рН внутри этих биопленок.

Мониторинг внеклеточного рН в кросс-Королевства Biofilms с помощью конфокальной микроскопии

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Протокол представляет собой простой в работе метод выращивания кросс-царства биопленки, состоящий из StreptococcuS. мутаны и Кандиды Альбиканы. Последующая конфокалярная микроскопия на основе соотношения рН позволяет точно контролировать развитие рН внутри внеклеточной матрицы этих биопленок.Тщательный выбор параметров получения изображений имеет первостепенное значение для получения данных изображения с достаточным контрастом для последующего анализа. рН-коэффициентметрия является быстрым, точным и недорогим методом изучения как горизонтальных, так и вертикальных градиентов рН в кросс-царстве биопленки в режиме реального времени. рН-коэффициентометрия также может быть выполнена в чисто грибковых и бактериальных биопленок.Метод способствует повышению нашего понимания микробного метаболизма в биопленки. Демонстрацией процедуры роста биопленки будет Анетт Аакджаер Томсен, техник из моей лаборатории. Выращиваем С.мутаны и К.альбиканы на агарных пластинах крови при 37 градусах Цельсия в аэробных условиях.Затем перенесите одиночные колонии каждого организма в пробирки, заполненные пятью миллилитров вливания сердца мозга и выращивайте их еще 18 часов. На следующий день центрифуга культур в 1200 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Resuspend клетки в физиологическом солевом растворе и отрегулировать OD 550 до 0.5 для обоих C.albicans и S.mutans.Затем разбавьте подвеску S.mutans от одного до 10 для достижения эквивалентных концентраций. Пипетт 50 микролитров стерильного слюнного раствора в колодцы оптического дна 96-хорошо пластины для микроскопии. Инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, затем мыть пластину три раза с 100 микролитров стерильного физиологического солевого раствора и опорожнить колодцы.Добавить 100 микролитров подвески C.albicans к каждой хорошо, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут, затем мыть хорошо три раза с солевым раствором. Затем добавьте к каждому колодец 100 микролитров тепловой инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода. Инкубировать тарелку в течение двух часов, затем мыть его три раза солевым раствором.Опустить скважины, но оставить 20 микролитров резервуар, чтобы избежать чрезмерного силы стрижки. Добавьте 100 микролитров подвески S.mutans и 150 микролитров BHI с 5%-ной сахарозой к каждой хорошо. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов или дольше.При выращивании старых биопленок, заменить средний ежедневно. В конце фазы роста кросс-царства, мыть пластину пять раз стерильным физиологическим солевым раствором. Для обработки соотношения pH используйте перевернутый конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с объективом 63X-масла или погружения в воду, лазерной линией 543 нанометров и спектральной системой визуализации.Используйте инкубатор для нагрева стадии микроскопа до 35 градусов по Цельсию. Установите детектор для одновременного обнаружения зеленой флуоресценции с 576 до 608 нанометров и красной флуоресценции с 629 до 661 нанометров. Затем выберите соответствующую мощность лазера и получить, чтобы избежать чрезмерного и недоэкспонированности.Установите размер пинхол до одного блока воздуха или оптического ломтика около 0,8 микрометров. Затем установите размер изображения до 512 на 512 пикселей и скорость сканирования до двух. Выберите строку в среднем из двух, используя средний вариант.Приготовьте 100 микролитров стерильного физиологического солевого раствора с 0,4%глюкозы, титрованной до рН семь. Затем сделайте стоковый раствор C-SNARF-4 и добавьте краситель в окончательную концентрацию 30 микромоляров. Пустая одна из скважин с кросс-царством биопленки оставив 20 микролитров резервуар и добавить солевой раствор с глюкозой и коэффициентометрического красителя.Поместите пластину на сцену микроскопа и начните визуализацию. Подготовьте серию буфера 50 миллимоляр МЕС, хихикаемого до рН от 4 до 7,8 с шагом в 0,2 рН при 35 градусах Цельсия. Пипетка 150 микролитров каждого буферного раствора в колодцы оптического дна 96-хорошо пластины.Добавьте краситель в заполненные буфером скважины с концентрацией 30 микромолей и дайте ему уравночные в течение пяти минут. Разогреть стадию микроскопа до 35 градусов по Цельсию и выбрать те же настройки, что и для соотношения параметрических изображений рН ранее описанных. Поместите пластину из 96 скважин на сцену микроскопа и сосредоточьтесь на дне колодцев.Приобретайте изображения зеленых и красных каналов для всех буферных решений. Через регулярные промежутки времени, принимать изображения с лазером выключен, чтобы исправить для детектора смещения. Выполните эксперимент по калибровке в тройном и экспортировать все изображения в качестве файлов TIFF.Храните зеленые и красные изображения в отдельных папках и переименуй обе серии файлов с последовательными числами. Импорт изображения в специальное программное обеспечение для анализа изображений, такое как ImageJ. На снимках, сделанных с выключением лазера, щелкните анализ и гистограмму, чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции.Вычесть это значение из изображений биопленки, нажав на процесс, математику и вычесть. Затем импортировать две серии изображений в дайме и выполнять пороговую сегментацию изображений красного канала, нажав сегмент, автоматическую сегментацию и пользовательский порог. Установите низкий порог выше интенсивности флуоресценции грибковой цитоплазмы и высокий порог ниже интенсивности стенок грибковых клеток и бактерий.Затем перенесите объектный слой сегментированных изображений в серию изображений зеленого канала, нажав на сегмент и перенесите слой объекта. Удалите неаумные пиксели в серии красных и зеленых каналов. Теперь биопленочные изображения очищены от бактериальных и грибковых клеток и могут быть экспортированы в качестве файлов TIFF.Импорт серии изображений обратно в ImageJ и разделить красный серии изображений сама по себе. Затем умножьте результат на оригинальную серию изображений. Полученная серия изображений идентична исходной, за исключением удаления всех пикселей нулевой интенсивности.Повторите этот процесс с помощью серии зеленых изображений. Далее используйте средний фильтр на обеих сериях изображений, чтобы компенсировать шум детектора. Разделите зеленый на ряд красных изображений, который затем дает соотношение зеленого к красному для всех объектов пикселей.Надежные кросс-царства биопленки разработаны в пластинах хорошо после 24 и 48 часов. Одиночные клетки и цепи S.mutans сгруппированы вокруг грибковых hyphae и больших внутриклеточных пространств указали на наличие объемной матрицы. РН во внеклеточном пространстве визуализировали с помощью таблицы осмотра.Внеклеточный рН в биопленки быстро упал в первые пять минут после воздействия глюкозы. После этого подкисление замедлилось, как правило, достигнув значений от 5,5 до 5,8 через 15 минут. Из-за локальных изменений рН интенсивность флуоресценции в биопленки со временем менялась.Во время сегментации изображений были выбраны высокие и низкие пороги для адекватного устранения всех областей, охватываемых бактериальными и грибковыми клетками. Синие и зеленые зоны были ликвидированы низкими и высокими порогами соответственно. Тщательный выбор параметров получения изображения имеет решающее значение для получения хорошего контраста между бактериальными клетками, грибковые клетки, и биопленки матрицы.Если кросс-царства биопленки выращиваются в клетках потока, рН события могут контролироваться в условиях потока имитирующих те, в полости рта. рН-коэффициентметрия была использована для выявления местных районов в стоматологических биопленок с особенно низким рН, так называемые ацидогенные горячие точки.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

96 Ну планшет метода, основанного на формировании мониторинга и тестирования Противогрибковые Восприимчивость Candida Albicans Биопленки

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Оценка противогрибковое действие изолированных альвеолярных макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Измерение рН фагосомы по Логометрический флуоресцентной микроскопии

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Логометрический визуализации внеклеточного рН в зубных биопленок

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...