Name: monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Anette Aakjær Thomsen och Javier E. Garcia är erkända för utmärkt teknisk support. Författarna tackar Rubens Spin-Neto för givande diskussioner om bildanalys.

Protokollet för salivsamlingen granskades och godkändes av Institutionen för Nya fri- och vattenlagen (M-20100032).
1. Odling av cross-kingdom Biofilms
<ol><li>Väx S. mutans DSM 20523 och C. albicans NCPF 3179 på blodagarplattor vid 37 °C under aeroba förhållanden.</li>
	<li>Överför enstaka kolonier av varje organism till provrör fyllda med 5 ml hjärnhjärtainfusion (BHI). Väx i 18 timmar under aeroba förhållanden vid 37 °C.</li>
	<li>Centrifug över natten ...

<ol>
	<li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungi+in+endodontic+infections.">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li><li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects.">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).</li><li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship.">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response.">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li><li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+&#956;-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions.">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate &#956;-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li><li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms.">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967 (2009).</li><li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model.">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis.">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li><li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo.">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li><li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo.">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).</li><li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exopolysaccharide+matrix:+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm.">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).</li><li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms.">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li><li>Schlafer, S., B&#230;lum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions.">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li><li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors.">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li><li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy.">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li><li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies.">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li><li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities:+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm.">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li><li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva.">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Daims, H., L&#252;cker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daime,+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research.">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li><li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans.">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).</li><li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms.">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li><li>Krzy&#347;ciak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm.">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans.">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).</li><li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix.">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4.">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li><li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine.">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li><li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm.">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299 (2011).</li><li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries:+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics,+Metatranscriptomics,+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome.">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).</li><li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+convection+around+biofilms.">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li><li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Flow+disrupts+communication.">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).</li></ol>

Olika protokoll för odling av cross-kingdom biofilmer som involverar C. albicans och Streptococcus spp. har beskrivits tidigare9,22,23,24,25. Den nuvarande installationen fokuserar dock på enkla tillväxtförhållanden, en tidsplan som är kompatibel med vanliga arbetsdagar, en balanserad artsammansättning och utvecklingen av en o...

Cross-kingdom biofilmer som omfattar både svamp och bakteriearter är involverade i flera patologiskt förhållanden i munhålan. Candida spp. har ofta isolerats från endodontiska infektioner1 och från parodontala lesioner2,3. Vid slemhinnor infektioner har streptokockarter från mitigruppen visat sig förbättra svampbiofilmbildning, vävnadsinvasion och spridning i både in vitro- och murinmodeller4,5,6,7. Mest intressant, oral transport av Candida spp. har visat sig vara förknippad med förekomsten av karies hos barn8. Som visas i gnagare modeller, en symbiotisk relation mellan Streptococcus mutans och Candidas albicans ökar produktionen av extracellulära polysackarider och leder till bildandet av tjockare och mer kardiogenbiofilmer9,10.
I alla ovan nämnda förhållanden, tidig barndom karies i synnerhet, biofilm pH är av betydelse för sjukdomsprogression, och den framstående roll biofilm matris för utveckling av suragenmikromiljöer11 kräver metoder som gör det möjligt att studera pH förändringar inuti cross-kingdom biofilmer. Enkla och korrekta konfokala mikroskopibaserade metoder för att övervaka pH inutibakteriella 12 och svamp13 biofilmer har utvecklats. Med det ratiometriska färgämnet C-SNARF-4 och tröskelbaserad bild efterbearbetning kan extracellulärpH bestämmas i realtid i alla tre dimensionerna av en biofilm14. Jämfört med andra publicerade tekniker för mikroskopibaserad pH-övervakning i biofilmer är pH-ratiometri med C-SNARF-4 enkel och billig, eftersom det inte kräver syntes av partiklar eller föreningar som innehåller ett referensfärgämne15 eller användning av tvåfotonexcitation16. Användningen av bara ett färgämne förhindrar problem med sondcompartmentalization, fluorescerande blödning och selektiv blekning16,17,18 samtidigt som det möjliggör en tillförlitlig differentiering mellan intra- och extracellulärpH. Slutligen utförs inkubation med färgämnet efter biofilmtillväxt, vilket gör det möjligt att studera både laboratorie- och insitu-odlade biofilmer.
Syftet med detta arbete är att utvidga användningen av pH ratiometri och ge en metod för att studera pH-förändringar i cross-kingdom biofilmer. Som konceptbevis används metoden för att övervaka pH i biofilmer med dubbla arter bestående av S. mutans och C. albicans som exponeras för glukos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Statens Serum Institut</td>
			<td>677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain heart infusion + 5 % sucrose</td>
			<td>BDH laboratory supplies</td>
			<td>10274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>National Collection of Pathogenic Fungi</td>
			<td>NCPF 3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>daime: digital image analysis in microbial ecology</td>
			<td>Universit&#228;t Wien</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco Life technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS-6R refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java</td>
			<td>Oracle</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>89626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCurveFit</td>
			<td>MyAssays Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHM210 pH-meter</td>
			<td>Radiometer Analytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 63x oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>NA=1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNARF&#174;-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S23920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile physiological saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptococcus mutans</td>
			<td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td>
			<td>DSM 20523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vis-spectrophotometer V-3000PC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL Incubator</td>
			<td>PeCON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 META</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring extracellular ph in cross-kingdom biofilms using confocal microscopy

Cross-kingdom biofilmer som består av både svamp och bakterieceller är involverade i en mängd olika orala sjukdomar, såsom endodontiska infektioner, parodontit, slemhinnor infektioner och, framför allt, tidig barndom karies. Under alla dessa förhållanden påverkar pH i biofilmmatrisen mikrob-värdinteraktioner och därmed sjukdomsprogressionen. Det nuvarande protokollet beskriver en konfokal mikroskopibaserad metod för att övervaka pH-dynamikinuti cross-kingdom biofilmer bestående av Candida albicans och Streptococcus mutans. PH-beroende dual-emission spektrum och färgning egenskaper ratiometric sonden C-SNARF-4 utnyttjas för att bestämma droppar i pH i extracellulära områden av biofilmer. Användning av pH-ratiometri med sonden kräver ett minutiöst val av bildframställningsparametrar, en grundlig kalibrering av färgämnet och noggrann, tröskelbaserad efterbehandling av bilddata. När den används på rätt sätt möjliggör tekniken en snabb bedömning av extracellulärt pH i olika områden av en biofilm och därmed övervakning av både horisontella och vertikala pH-gradienter över tiden. Medan användningen av konfokal mikroskopi begränsar Z-profilering till tunna biofilmer på 75 μm eller mindre, är användningen av pH-ratiometri idealisk för den noninvasive studien av en viktig virulensfaktor i cross-kingdom biofilmer.

Efter 24 h och 48 h, robusta cross-kingdom biofilmer utvecklas i brunnen plattor. C. albicans visade varierande grad av glödande tillväxt, och S. mutans bildade täta kluster på upp till 35 μm i höjd. Enstaka celler och kedjor av S. mutans grupperade kring svamphyphae, och stora intercellulära utrymmen indikerade förekomsten av en omfattande matris (figur S1).
Kalibrering av det ratiometriska färgämnet ger en asymmetrisk sigmoidalkurva<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy at JoVE.com

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Protokollet beskriver odling av cross-kingdom biofilmer som består av Candida albicans och Streptococcus mutans och presenterar en konfokal mikroskopi-baserad metod för övervakning av extracellulära pH inuti dessa biofilmer.

Övervakning ExtracellulärpH i cross-kingdom biofilmer med confocal mikroskopi

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Protokollet presenterar en lätt att utföra metod för odling av cross-kingdom biofilms bestående av StreptococcuS. mutans och Candida albicans. Efterföljande confocal microscopy-baserade pH ratiometry möjliggör noggrann övervakning av pH-utvecklingen inuti extracellulära matrisen av dessa biofilmer.Det noggranna valet av bildanskaffningsparametrar är av yttersta vikt för att få fram bilddata med tillräcklig kontrast för efterföljande analys. pH ratiometry är en snabb, exakt och billig metod för att studera både horisontella och vertikala pH-gradienter i gränsöverskridande biofilmer i realtid. pH-ratiometri kan också utföras i rent svamp- och bakteriebiofilmer.Metoden bidrar till att öka vår förståelse för mikrobiell metabolism i biofilmer. Demonstrerar proceduren för biofilmtillväxt blir Anette Aakjaer Thomsen, en tekniker från mitt laboratorium. Odla S.mutans och C.albicans på blodagarplattor vid 37 grader Celsius under aeroba förhållanden.Överför sedan enstaka kolonier av varje organism till provrör fyllda med fem milliliter av hjärnans hjärta infusion och odla dem i ytterligare 18 timmar. Nästa dag centrifugera kulturerna vid 1, 200 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Resuspend cellerna i fysiologisk koksaltlösning och justera OD 550 till 0,5 för både C.albicans och S.mutans.Späd sedan S.mutans suspensionen en till 10 för att uppnå likvärdiga koncentrationer. Pipett 50 mikroliter av sterila salivary lösning i brunnarna i en optisk botten 96-brunnsplatta för mikroskopi. Inkubera plattan i 30 minuter vid 37 grader Celsius, sedan tvätta plattan tre gånger med 100 mikroliter av steril fysiologisk koksaltlösning och tömma brunnarna.Tillsätt 100 mikroliter C.albicans suspension till varje brunn, inkubera plattan på 37 grader Celsius i 90 minuter, tvätta sedan brunnen tre gånger med saltlösning. Därefter lägger till 100 mikroliter av värme-inaktiverade fetala nötkreatur serum till varje brunn. Inkubera plattan i två timmar, tvätta den sedan tre gånger med saltlösning.Töm brunnarna men lämna en 20 mikroliter reservoar för att undvika överdrivna skjuvkrafter. Tillsätt 100 mikroliter av S.mutans fjädring och 150 mikroliter av BHI med 5%sackaros till varje brunn. Sedan inkubera plattan på 37 grader Celsius i 24 timmar eller längre.Vid odling av äldre biofilmer, byt ut mediet dagligen. I slutet av korsriket tillväxtfasen, tvätta plattan fem gånger med steril fysiologisk koksaltlösning. För ratiorisk pH-avbildning, använd ett inverterat konfokalt laserscanningsmikroskop med en 63X-olja eller vatten nedsänkning lins, en 543 nanometer laserlinje, och ett spektralt avbildningssystem.Använd en inkubator för att värma mikroskopet scenen till 35 grader Celsius. Ställ in detektorn för samtidig detektering av grön fluorescens från 576 till 608 nanometer och röd fluorescens från 629 till 661 nanometer. Välj sedan en lämplig laserkraft och vinna för att undvika över och underexponering.Ställ in tapphålsstorleken på en luftenhet eller en optisk skiva på ca 0,8 mikrometer. Ställ sedan in bildstorleken på 512 med 512 pixlar och skanningshastigheten till två. Välj ett linjegenomsnitt på två med hjälp av alternativet medelvärde.Förbered 100 mikroliter av steril fysiologisk koksaltlösning med 0,4%glukos titrerad till pH sju. Gör sedan en stamlösning av C-SNARF-4 och tillsätt färgämnet till en slutlig koncentration av 30 mikromolar. Töm en av brunnarna med den tvärrikebiofilm som lämnar en 20 mikroliterreservoar och tillsätt saltlösningen med glukos och ratiometriskt färgämne.Placera plattan på mikroskopet scenen och börja bildbehandling. Förbered en serie av 50 millimolar MES buffert titrerad till pH fyra till 7,8 i steg om 0,2 pH-enheter vid 35 grader Celsius. Pipett 150 mikroliter av varje buffertlösning i brunnarna på en optisk botten 96-brunnsplatta.Tillsätt färgämnet till de buffertfyllda brunnarna i en koncentration av 30 mikromolar och låt det ekvila i fem minuter. Värm mikroskopet scenen till 35 grader Celsius och välja samma inställningar som för ratiometric pH-avbildning tidigare beskrivits. Placera 96-brunnsplattan på mikroskopstadiet och fokusera på brunnarnas botten.Skaffa gröna och röda kanalbilder för alla buffertlösningar. Med jämna mellanrum, ta bilder med lasern avstängd för att korrigera för detektor offset. Utför kalibreringsexperimentet i tre exemplar och exportera alla bilder som TIFF-filer.Lagra de gröna och röda bilderna i separata mappar och byt namn på båda serierna med sekventiella nummer. Importera bilderna till dedikerade bildanalysprogram som ImageJ. I bilderna tagna med lasern av, klicka på Analysera och histogram för att bestämma den genomsnittliga fluorescens intensitet.Subtrahera detta värde från biofilmens bilder genom att klicka på process, matematik och subtrahera. Importera sedan de två bildserierna till daime och utför en tröskelbaserad segmentering av de röda kanalbilderna genom att klicka på segment, automatisk segmentering och anpassat tröskelvärde. Ställ in den låga tröskeln över svampcytoplasmans fluorescensintensitet och den höga tröskeln under svampcellsväggarnas och bakteriernas intensitet.Överför sedan objektlagret för den segmenterade bildserien till den gröna kanalbildsserien genom att klicka på segment och överföra objektlager. Ta bort pixlar som inte är objekt i den röda och gröna kanalserien. Nu är biofilmbilderna rensade från bakterie- och svampceller och kan exporteras som TIFF-filer.Importera bildserien tillbaka till ImageJ och dela den röda bildserien av sig själv. Multiplicera sedan resultatet med den ursprungliga bildserien. Den resulterande bildserien är identisk med originalet utom alla nollintensitetspixlar tas bort.Upprepa processen med den gröna bildserien. Därefter använder medelvärdet filter på båda bildserien för att kompensera för detektor buller. Dela upp det gröna med den röda bildserien som sedan ger det grön-röd-talet för alla objektpixlar.Robusta korsrikedrikebiofilmer utvecklades i brunnsplattorna efter 24 och 48 timmar. Enstaka celler och kedjor av S.mutans grupperade runt svamp hyfer och stora intracellulära utrymmen anges förekomsten av en voluminös matris. PH i extracellulära utrymmet visualiserades med hjälp av en uppslagstabell.Det extracellulära pH-värdet i biofilmerna sjönk snabbt under de första fem minuterna efter exponering för glukos. Därefter avtog försurningen vanligtvis att nå värden på 5,5 till 5,8 efter 15 minuter. På grund av de lokala pH-förändringarna förändrades fluorescensintensiteten i biofilmerna med tiden.Under bild segmentering, valdes höga och låga tröskelvärden för att på ett adekvat sätt eliminera alla områden som omfattas av bakterie- och svampceller. De blå och gröna områdena eliminerades av de låga respektive höga trösklarna. Det noggranna valet av bildförvärvsparametrar är avgörande för att få en bra kontrast mellan bakterieceller, svampceller och biofilmmatrisen.Om cross-kingdom biofilmer odlas i flödesceller, pH utveckling kan övervakas under flöde skick härma de i munhålan. pH ratiometry har använts för att identifiera lokala områden i dentala biofilmer med särskilt lågt pH, så kallade acidogenic hotspots.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualisera cell till cell överföring av hiv med fluorescerande kloner av hiv och Live konfokalmikroskopi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

En 96 Väl mikrotiterplatta-baserad metod för övervakning Bildning och svampdödande resistensbestämning av Candida albicans Biofilmer

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Mätning Phagosome pH genom Propportionell fluorescensmikroskopi

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

Propportionell Imaging av extracellulära pH i Tand Biofilmer

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...