Name: enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment
Uploaded: 2019-09-17T15:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment at JoVE.com

हम प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनके योगदान के लिए सभी कोटाजा प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और सक्रिय उपयोग और उनके अनुसंधान परियोजनाओं में प्रोटोकॉल के परीक्षण. विशेष रूप से हम प्रोटोकॉल के अनुकूलन में मदद के लिए जन Lindstrm के योगदान की सराहना करते हैं. इस अध्ययन फिनलैंड की अकादमी द्वारा समर्थित किया गया था, सिग्रिड Jus-lius फाउंडेशन, और आणविक चिकित्सा के Turku डॉक्टरेट कार्यक्रम.

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYCO1+and+autophagy+control+the+integrity+of+the+haploid+male+germ+cell-specific+RNP+granules.">FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules.</a> Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. 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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

यहाँ प्रस्तुत एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल दौर शुक्राणुओं की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए है, pachytene spermatocytes, और मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर spermatids लंबा (चित्र4 में दिखाया प्रोटोकॉल का अवलोकन). हालांकि कोई विशेषज्ञता या महंगी मशीनरी की आवश्यकता है, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि ऊतक पाचन के दौरान विचार किया जाना चाहिए रहे हैं, ढाल के निर्माण, और ढाल पर सेल निलंबन की लोडिंग.
रोगाणु कोशिकाओं को लगातार एंजाइमी पाचनों द्वारा अर्धनाश नलिकाओं से जारी किया जाता है। कोलैजाज़ चतुर्थ के साथ पहला पाचन अंतरालीय कोशिकाओं को हटाने के द्वारा seminiferous ट्यूब्यूल अलग करता है। लंबे समय तक पाचन समय ट्यूबल को नुकसान पहुंचा सकता है और शुक्राणुओं की हानि का कारण बन सकता है, क्योंकि (यदि इस चरण के दौरान ट्यूबल से जारी किया जाता है) वे निम्न चरणों में छोड़ दिए जाएंगे। ट्रिप्सिन के साथ दूसरा पाचन चरण अर्धनीशुक्र नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को मुक्त करता है। वहाँ कभी कभी सेल lysis हो सकता है और आम तौर पर कुछ clumps जारी जीनोमिक डीएनए के कारण फार्म. पाचन की सिफारिश की अवधि या तापमान से अधिक की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि इससे गरीब व्यवहार्यता, सेल lysis में वृद्धि हो सकती है, और क्लंपिंग हो सकती है। यदि हल्के clumping होता है, clumps नजरअंदाज किया जा सकता है. हालांकि, महत्वपूर्ण clumping और कोशिकाओं की हानि के मामलों में, trypsin पाचन समय या एकाग्रता कम किया जाना चाहिए. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रिप्सिन की एंजाइमी गतिविधि बैचों के बीच और भंडारण के लंबे समय के दौरान भिन्न हो सकती है। Trypsin पाचन के दौरान DNase मैं की मात्रा भी अतिरिक्त clumps को दूर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह एक माध्यमिक समाधान माना जाना चाहिए. पूर्व-उपचार के अंत में एक समरूप एकल सेल निलंबन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्लंप्ड कोशिकाएं तेजी से तलछट करेंगी, भिन्नों को दूषित करेंगी और ढाल को बाधित करेंगी।
ग्रेडिएंट का निर्माण करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है. यदि एक पिपेट नियंत्रक के साथ एक 5 एमएल पिपेट टिप का उपयोग कर परेशानी है, यह एक चिकनी पिस्टन के साथ एक सामान्य 1 एमएल यांत्रिक पिपेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है तो व्यास में $ 3 मिमी के एक एपर्चर के लिए पिपेट युक्तियों में कटौती (चित्र 1बी)। बीएसए समाधान की एक व्यापक एपर्चर और चिकनी लोडिंग ढाल मिश्रण का खतरा कम हो जाएगा। जब ठीक से तैयार किया जाता है, तो उनके विभिन्न अपवर्तक सूचकांकों के कारण आसन्न बीएसए समाधानों के बीच की सीमाओं को देखना संभव है। ग्रेडिएंट का उपयोग करने से पहले सीधे उत्पादित किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोई भी छोटा मिलाते हुए या कंपन ढाल को परेशान कर सकता है, इसलिए ढाल को ऐसे वातावरण में स्थापित किया जाना चाहिए जहां इसे परेशान नहीं किया जाएगा।
ग्रेडिएंट पर सेल निलंबन की लोडिंग बहुत सावधानी से की जानी चाहिए। लोड करने के बाद, सेल निलंबन ढाल के शीर्ष पर रहना चाहिए, जिसमें से कोशिकाओं को धीरे-धीरे पहली परत के माध्यम से तलछट करने के लिए शुरू कर देंगे। यदि कोशिकाओं के बड़े समूहों को ग्रेडिएंट के माध्यम से तेजी से आगे बढ़ते हुए देखा जाता है, तो कोशिकाओं को संभवतः सावधानी से पुन: निलंबित नहीं किया गया था या अतिरिक्त झुरमुट है। यदि कोशिकाओं लोड हो रहा है पर discontinuous बीएसए ढाल के शीर्ष पर नहीं रहते हैं, लेकिन तुरंत 1% और 2% बीएसए परतों (चरण 3.6) के बीच सिंक, सेल निलंबन की संभावना भी घने है. इस प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस के दो testes का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है (80-120 mg/testis) प्रारंभिक सामग्री के रूप में; हालांकि, शुरू सामग्री की कम मात्रा का उपयोग कर सफल isolations किया गया है. प्रोटोकॉल upscale और testes की उच्च संख्या से अधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, ढाल के साथ अधिक 50 एमएल ट्यूब शुरू किया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल शुरू में विकसित किया गया था और वयस्क माउस testes से अगुणित दौर शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए अनुकूलित, और दौर spermatid अंशों की शुद्धता से अधिक होने की उम्मीद है 90%. अत्यधिक शुद्ध दौर spermatid अंशों के अलावा, pachytene spermatocytes और लंबी spermatids के संवर्धन के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए गए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एरिथ्रोसाइट्स लंबे शुक्राणुओं के अंशों को दूषित कर सकते हैं, और उन्हें खत्म करने के लिए आगे कदम उठाए जाने चाहिए यदि उनकी उपस्थिति से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप करने की उम्मीद की जाती है। हम एमडीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर वयस्क चूहों से premeiotic या जल्दी meiotic कोशिकाओं (pachytene चरण के लिए पूर्व) के रूप में अन्य सेल प्रकार को समृद्ध करने में सक्षम नहीं किया गया है.
इसके अतिरिक्त, एसटीए-PUT अवसादन सफलतापूर्वक जन्म13के बाद दिए गए समय बिंदु पर एकत्र किशोर testes का उपयोग कर शुक्राणुगोनिया या preleptotene, लेप्टोटेन, और युग्मनज शुक्राणु कोशिकाओं के समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण शुक्राणुजनन की पहली लहर के दौरान इन कोशिका प्रकारों की उपस्थिति का लाभ लेता है। एक ही दृष्टिकोण की संभावना एमडीआर संवर्धन के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह अभी तक व्यवहार में परीक्षण नहीं किया गया है. एक अन्य विधि है कि भेदभाव के विशिष्ट चरणों में premeiotic और meiotic कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक अच्छा विकल्प है FACS है, जो उपस्थिति विशिष्ट मार्करों के आधार पर विशिष्ट कोशिकाओं प्रकार के अलगाव की अनुमति का महत्वपूर्ण लाभ है14 ,15,16,17.
कुल मिलाकर, एमडीआर वेग अवसादन रोगाणु सेल संवर्धन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है। हालांकि इस विधि की शुद्धता या समृद्ध कोशिकाओं की मात्रा के मामले में अन्य अच्छी तरह से स्थापित तरीकों से बेहतर नहीं है, इसके स्पष्ट लाभ अपनी सादगी और कम सेट अप लागत हैं. यह, एक साथ आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की कम राशि के साथ, इस प्रोटोकॉल spermatogenesis क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक बढ़िया विकल्प प्रदान करते हैं और अन्य क्षेत्रों में जो विशेष हार्डवेयर या जानवरों के बड़े समूहों में निवेश करने की इच्छा नहीं हो सकता है.

स्तनधारी शुक्राणुजनन के दौरान होने वाली आणविक और जैविक घटनाओं के बारे में बहुत कुछ पता नहीं है, एक जटिल प्रक्रिया जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम कोशिकाएं अत्यधिक विशिष्ट शुक्राणुजोआ1,2में परिवर्तित हो जाती हैं . शुक्राणुजनन वृषण के अर्धनीफेरस नलिकाओं के अंदर होता है। नलिकाओं में विभेद के प्रत्येक चरण से रोगाणु कोशिकाओं का मिश्रण होता है, जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम सेल, माइटोटिक रूप से शुक्राणुओं को विभाजित करना, मेरियोटिक शुक्राणुकोशिकाएं, और डािमियोटिक शुक्राणुओं (जो गोल से अगुणित विभेदक होते हैं) शुक्राणुओं को लंबा करने के लिए शुक्राणु, और अंत में परिपक्व शुक्राणुजोआ के लिए). वृषण की कायिक कोशिकाओं में सेर्तोली कोशिकाओं को शामिल किया गया है जो अर्धनारीश्य नलिकाओं के अंदर रोगाणु कोशिकाओं के साथ intermingled हैं, peritubular myoid कोशिकाओं है कि ट्यूब्यूल की दीवारों के रूप में, और टेस्टोस्टेरोन का उत्पादन Leydig कोशिकाओं ट्यूब्यूल्स के बीच अंतरालीय अंतरिक्ष में.
शुक्राणुजनन के दौरान आणविक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन अक्सर वृषण कोशिकाओं के एक जटिल मिश्रण से अलग रोगाणु कोशिकाओं की जुदाई की आवश्यकता है. सेल संवर्धन के लिए कई अलग-अलग कार्यनीतियां विकसित की गई हैं। सबसे सफल तरीके हैं एसटीए-पुट वेग अवसादन इकाई गुरुत्वाकर्षण3,4,5,6, केन्द्रापसारक उन्मूलन के आधार पर प्रतिप्रवाह केन्द्रीकरण7,8, और फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) जो डीएनए सामग्री और/या विशिष्ट मार्कर के अनुसार कोशिकाओं को अलग करता है। इन तरीकों आमतौर पर शुक्राणुजनन शोधकर्ताओं के बीच उपयोग किया जाता है और विशिष्ट रोगाणु सेल प्रकार के कुशल संवर्धन के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, इन तकनीकों की एक सीमा है कि वे विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है कि विशेष, महंगा हार्डवेयर की आवश्यकता है.
यहाँ प्रस्तुत माउस testes के तीन सबसे प्रचुर मात्रा में सेल आबादी की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल है: दौर शुक्राणुओं, pachytene spermatocytes, और लंबी spermatids. इस प्रोटोकॉल दौर spermatids (एमडीआर) के लिए संशोधित घनत्व ढाल के रूप में जाना जाता है, क्योंकि यह दौर spermatids को समृद्ध करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता है. एमडीआर विधि एसटीए-पुट वेग अवसादन के रूप में एक ही सिद्धांतों पर आधारित है, अभी तक यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है. जीवित कोशिकाओं को पृथ्वी के गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के तहत एक मानक 50 एमएल ट्यूब के अंदर मैन्युअल रूप से तैयार discontinuous विच्छिन्न सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से तलछट करने के लिए अनुमति दी जाती है। बड़ी कोशिकाएं प्रवणता के माध्यम से तेजी से गति करती हैं, जो रोगाणु कोशिकाओं की विभिन्न आबादियों को अलग करती हैं। अवसादन के बाद, तीन सेल प्रकारों के समृद्ध अंश मैन्युअल रूप से एकत्र किए जाते हैं। इन समृद्ध कोशिका ओंपियों की शुद्धता एसटीए-PUT और केन्द्रापसारक उन्मूलन द्वारा प्राप्त की गई आबादी के बराबर है।
वेग अवसादन के लिए बीएसए ढाल के निर्माण और उपयोग को कवर करने के अलावा, प्रोटोकॉल भी अर्द्धनीफेरस ट्यूब्यूल से वृषण कोशिकाओं को जारी करने के लिए एक पाचन विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल कि Romrell एट अल9 द्वारा विकसित से संशोधित किया गया था और collagenase चतुर्थ और trypsin के साथ अनुक्रमिक पाचन भी शामिल है. एक बाइकार्बोनेट बफर (अर्थात, क्रेब्स समाधान) के उपयोग के साथ संयुक्त अनुक्रमिक पाचनों को रोगाणु कोशिकाओं की पृथक्करण और व्यवहार्यता को बहुत अधिक बढ़ाने के लिए दर्शाया गयाहै 9।
एमडीआर संवर्धन के दौरान, कोशिकाओं के आसपास खर्च 4 ज एक साथ seminiferous tubules के वातावरण के बाहर और तनावपूर्ण यांत्रिक बलों के अधीन नहीं हैं, जो बहाव विश्लेषण के लिए अत्यधिक व्यवहार्य सेलुलर अंशों के संग्रह के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, केन्द्रापसारक उन्मूलन और एसटीए-PUT के समान, एमडीआर प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के किसी भी रासायनिक उपचार या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जो उनकी व्यवहार्यता को बनाए रखने में भी मदद करता है। महत्वपूर्ण बात, के रूप में छोटे रूप में दो वयस्क माउस testes एमडीआर अलगाव के लिए पर्याप्त हैं और इसलिए, एक वयस्क माउस दोनों आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त समृद्ध कोशिकाओं प्रदान करता है. मानक STA-PUT प्रोटोकॉल सेलअलगाव6 के लिए के रूप में कई के रूप में 12 वयस्क चूहों के उपयोग की सिफारिश की; हालांकि, पूर्व अनुभव के आधार पर, यह ज्ञात है कि सफल अलगाव तीन से चार वयस्क चूहों से किया जा सकता है. केन्द्रापसारक एल्यूट्रेशन के लिए पर्याप्त होने की सूचना दी प्रारंभिक सामग्री की सबसे कम मात्रा छह माउस testes (तीन चूहों)8है. इसलिए, महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त करने के अलावा, एमडीआर प्रोटोकॉल आवश्यक प्रयोगशाला पशुओं की संख्या को कम कर देता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>HyTest</td>
			<td>5G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL1</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>G82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL2, clone 13E-3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>for Alexa Fluor immunostainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit IgG</td>
			<td>Neomarkers</td>
			<td>NC-100-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>for standard DAPI analysis of cell fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartolab BT 180C6</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL or 2 ml tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell sieves for 50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td>or equivalent cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture incubator</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge for 50 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen for microscopy glass slides</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>or equivalent cell rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection forcepts</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscopy glass slides and coverslips</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy Acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155 000</td>
			<td>or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips for 1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment

शुक्राणुजनन के प्रत्येक चरण की विशेषता के लिए, शोधकर्ताओं को रोगाणु कोशिकाओं के विभिन्न उप-जनसंख्या को वृषणों से अलग करना चाहिए। हालांकि, अलग अलग आबादी को अलग करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि वयस्क वृषण में कायिक कोशिकाओं की कुछ आबादी के साथ शुक्राणुजनन के सभी चरणों से रोगाणु कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होता है। पिछले कुछ दशकों में, विभिन्न तकनीकों जैसे केन्द्रापसारक उन्मूलन, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस), और एसटीए-PUT को रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। एक दोष यह है कि वे सभी समर्पित उपकरणों और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है. एसटीए-PUT विधि अंतर्निहित सिद्धांतों के बाद, pachytene spermatocytes के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, गोल spermatids, और माउस testes से लंबे शुक्राणु. वृषण कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के बाद, विशिष्ट सेल आबादी एक discontinuous गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण अवसादन से समृद्ध हैं. कोशिका अंश तो मैन्युअल रूप से एकत्र कर रहे हैं और सूक्ष्म विश्लेषण किया. गोल शुक्राणुओं के लिए यह संशोधित घनत्व ढाल (एमडीआर) अवसादन प्रोटोकॉल व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणकी आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल कम से कम शुरू सामग्री की आवश्यकता है, इसकी लागत और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग को कम करने.

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Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

यहाँ प्रस्तुत pachytene spermatocytes, गोल शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, और वयस्क माउस testes से बढ़ते शुक्राणुओं मानक प्रयोगशाला उपकरण ों के साथ एक discontinuous गोवाइन सीरम एल्बुमिन घनत्व ढाल का उपयोग कर.

मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर माउस टेस्ट से Pachytene शुक्राणुकोशिकाओं और शुक्राणुओं का संवर्धन

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

सरल और सस्ती विधि जिसे हम एमडीआर कहते हैं, आपको पाचिटेन शुक्राणुओं, गोल शुक्राणुओं और माउस टेस्ट से शुक्राणुओं को बढ़ाने की समृद्ध आबादी को अलग करने की अनुमति देता है। एमडीआर विधि का मुख्य लाभ इसकी सादगी है। आपको केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता है जो अधिकांश जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं।एमडीआर प्रोटोकॉल पुरुष रोगाणु कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन कर रहे शोधकर्ताओं के लिए महान है। उदाहरण के लिए, ऐसे समूह जो शुक्राणुओं का अध्ययन कर रहे हैं, पुरुष प्रजनन क्षमता को प्रभावित करने वाले कारक, साथ ही पैतृक एपिजेनेटिक विरासत भी। एमडीआर विधि के लिए न्यूनतम शुरुआती सामग्री की आवश्यकता होती है।और वास्तव में, हम नियमित रूप से सिर्फ एक वयस्क पुरुष माउस का उपयोग कर कोशिकाओं की अच्छी मात्रा में प्राप्त करते हैं। आवश्यक उपकरण और अभिकर् में स्थापित करके शुरू करें। ३७ डिग्री सेल्सियस और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर ३४ डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और ९५% आर्द्रता के लिए एक पानी स्नान सेट करें ।इनक्यूबेटर के अंदर एक ट्यूब रोटेटर रखें। तैयार करें और माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड की उचित मात्रा लेबल करें, फिर तेल कलम के साथ व्यास में लगभग एक सेंटीमीटर की अंगूठी खींचें, और तेल को सूखने दें। जब जानवर को विच्छेदन करने के लिए तैयार हो, तो माउस के वेंट्रल पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और पेट पेल्विक गुहा में वी आकार खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें।संदंश के साथ एपीडिडिमल फैट पैड पर खींचें, टेस्ट्स का पता लगाएं और उन्हें कैंची से हटा दें, जिससे ट्यूनिका एल्बुगिनिया को परेशान करने से बचना सुनिश्चित हो। टेस्ट्स को छह सेंटीमीटर पेट्री डिश पर रखें जिसमें 1X क्रेब्स होते हैं । टेस्ट को हटा दें और ट्यूनिका एल्बुगिनिया को त्याग दें, फिर धीरे-धीरे उन्हें संदंश के साथ अलग करके अर्धनिफेरस ट्यूबल को थोड़ा फैलाएं।उन्हें एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें दो मिलीलीटर हौसले से तैयार कोलेजनस समाधान होते हैं। तीन मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ट्यूबल्स इनक्यूबेट, उंहें धीरे से कमाल से आंदोलन । फिर गर्म 1X KREBS के कम से ४० मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूबल्स को कमरे के तापमान पर तलछट की अनुमति दें ।सुपरनेट निकालें और एक बार फिर धोएं दोहराएं। हौसले से तैयार ट्रिप्सिन समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़ें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर रोटेटर पर ट्यूब रखें, और इसे लगभग 15 आरपीएम पर घुमाते हुए 15 से 20 मिनट के लिए छोड़ दें।छिटपुट रूप से ट्यूबलों की जांच करें। एक बार जब समाधान बादल बन जाता है और ट्यूबल के केवल छोटे टुकड़े रहते हैं, तो ट्यूब को बर्फ पर रखें और अगले चरण में आगे बढ़ें। बर्फ पर एक नया 50 मिलीलीटर शंकु नली में एक 40 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।फिर कोशिकाओं को गोली मारने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ६०० एक्स जी पर इसे अपकेंद्रित्र करें । ध्यान से सुपरनैंट डालें और 1X KREBS के शेष में कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए सेल पेलेट को टैप करें। पुनः निलंबित कोशिकाओं में कम से कम 40 मिलीलीटर ठंड 1X KREBS जोड़ें और अपकेंद्रित्र दोहराएं।ट्यूब को टैप करके कोशिकाओं को फिर से रीसुस्ल करें। फिर एक मिलीलीटर पिपेट पर एक पिपेट टिप माउंट करें और इसे काट लें ताकि एपर्चर व्यास में लगभग तीन मिलीमीटर हो। KREBS में 0.5% बीएसए के तीन मिलीलीटर तक जोड़ें।कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पुनर्सुन करें, जिससे बुलबुले से बचना सुनिश्चित हो। सेल सस्पेंशन को 40 माइक्रोमीटर छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें और बीएसए ढाल पर कोशिकाओं को लोड करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें। ढाल पर कोशिकाओं को लोड करने से पहले अपने एक सजातीय एकल सेल निलंबन प्राप्त करना चाहिए।झुरमुट कोशिकाएं तेजी से तलछट करेंगी, जिससे आपके ढाल में खलल पड़ेगा और अंश दूषित होंगे। बर्फ पर खड़ी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब सेट करें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि ट्यूब के एक तरफ देखना संभव है। फिर दस मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट की नोक से लगभग पांच से दस मिलीमीटर काटें और इसे एक पिपेट नियंत्रक पर माउंट करें।50 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे में 5% बीएसए समाधान के पांच मिलीलीटर पिपेट। धीरे-धीरे पिपेट के कट टिप के साथ 5% समाधान की सतह को स्पर्श करें और धीरे-धीरे 5% समाधान के शीर्ष पर 4% बीएसए समाधान के पांच मिलीलीटर परत करें। 5% से 1% बीएसए के ढाल प्राप्त करने के लिए अन्य बीएसए समाधानों के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।परतों के बीच एक स्पष्ट रेखा दिखाई नी चाहिए। फिर ध्यान से इसे परेशान किए बिना ढाल के शीर्ष पर एकल सेल निलंबन लोड करें। कोशिकाओं को डेढ़ घंटे तक ढाल के माध्यम से तलछट दें।एक कट पिपेट टिप का उपयोग करके, ध्यान से एक मिलीलीटर अंशों को अलग-अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में इकट्ठा करें और उन्हें बर्फ पर स्टोर करें, जिससे ट्यूबों को उस क्रम में संख्या में रखना सुनिश्चित किया जा सके जो उन्हें एकत्र किया गया था। सेंट्रलाइज रोगाणु कोशिका के अंशों को चार डिग्री सेल्सियस पर दस मिनट के लिए ६०० x g पर । फिर इस बात का ध्यान रखते हुए कि गोली को परेशान न करें, अधिकांश सुपरनेट को त्यागें और ट्यूब को फ्लिक करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।प्रत्येक ट्यूब में बर्फ ठंड 1X KREBS बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र दोहराएं। अधिकांश सुपरनेट को त्यागें, लगभग 100 माइक्रोलीटर छोड़ दें और सेल पेलेट को सावधानी से फिर से खर्च करें। कोशिका के अंशों का विश्लेषण करने के लिए, एक गिने-चुने माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर प्रत्येक तेल पेन रिंग के अंदर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 20 माइक्रोलीटर को पाइपिंग करके शुरू करें।तुरंत इसी अंश से पुनर्कृतित कोशिकाओं के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर कम से कम एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड सूख। पीबीएस के साथ एक बार स्लाइड कुल्ला और दापी के साथ एक बढ़ते माध्यम का उपयोग करने के लिए स्लाइड माउंट .प्रत्येक अंश में कौन सा विशेष रोगाणु कोशिका प्रकार समृद्ध है, इसका अनुमान लगाने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे प्रत्येक स्लाइड का विश्लेषण करें। एक बार प्रत्येक अंश से एक नमूना माइक्रोस्कोपी के लिए लिया गया है, प्रत्येक अंश के लिए बर्फ ठंड 1X KREBS के एक मिलीलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर दस मिनट के लिए ६०० से १३००० एक्स ग्राम पर नीचे कोशिकाओं अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को निकालें और त्यागें और पसंदीदा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण जारी रखें।यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से गोल शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है। ९०% से ऊपर संवर्धन दो, तीन और चार अंशों में हासिल किया गया था । लम्बी शुक्राणु ढाल के शीर्ष पर रहने के लिए करते हैं और पहले अंश के साथ एकत्र किए गए थे।उनके बड़े आकार के कारण, pachytene शुक्राणु तलछट तेजी से और पिछले एकत्र किए गए थे । संवर्धन 14 और 15 अंशों में लगभग 75% था। कुल आरएनए अंशों के बहुमत से प्राप्त ०.५ से २.५ माइक्रोग्राम, डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण के लिए पर्याप्त से लेकर ।प्रत्येक अंश से प्राप्त प्रोटीन की मात्रा आमतौर पर 20 से 140 माइक्रोग्राम तक होती है, जो कई पश्चिमी ब्लॉट्स के लिए पर्याप्त है। इस प्रोटोकॉल में, एकल अंशों से प्राप्त प्रोटीन lysates का 10% स्पष्ट रूप से एक मानक पश्चिमी दाग पर DDX4, PIWIL1 और PIWIL2 प्रोटीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त था । एक अंश में प्रोटीन की मात्रा PIWIL1 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके और साथ ही कोइम्यूनोप्रिपिटेटेड PIWIL2 का पता लगाने के लिए इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए भी पर्याप्त थी।यहां तक कि पहली टाइमर के लिए, यह प्रोटोकॉल बहुत अच्छी तरह से काम करता है जब तक आप यह सुनिश्चित करते हैं कि आपकी कोशिकाओं का पूर्व-उपचार अच्छा है, और तलछट के दौरान कुछ भी आपके ढाल को परेशान नहीं करता है। एक माउस से, आपको अत्यधिक समृद्ध कोशिकाएं मिलती हैं, जिनका उपयोग आरटी-पीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, इम्यूनोप्रिपिटेशन और वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसे विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है। जबकि एमडीआर पुरुष रोगाणु कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एकमात्र तरीका नहीं है, यह एक बहुत ही सुविधाजनक उपकरण है क्योंकि इसके लिए किसी विशेष उपकरण या व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

अलगाव और मानव का संवर्धन बढ़ी अस्थिजनन के लिए stromal कोशिकाओं वसा व्युत्पन्न

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

उच्च throughput के Microplate श्वसन माप के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी की कम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया पृथक का उपयोग

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

स्टेप-विशिष्ट माउस spermatids की छंटनी फ्लो द्वारा

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

पृष्ठीय माउस त्वचा से बाल कूप स्टेम कोशिकाओं और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाएं अलग

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

माउस एमनियोटिक द्रव कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन के एक transposon प्रणाली का प्रयोग

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

रक्त कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पीढ़ी सेंडाइ वायरस और centrifugation का उपयोग

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

माउस में प्रारंभिक गर्भावस्था लक्षण वर्णन के लिए तीन आयामी उच्च आवृत्ति ट्रा का एक उपंयास का उपयोग

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

एक उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड (30/45MHZ) प्रणाली का उपयोग भ्रूण माउस हृदय इमेजिंग

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

गुणसूत्रों के Micromanipulation में कीट Spermatocytes

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

ऊतक तैयारी और माउस Craniofacial ऊतकों और undecalified हड्डी के इम्यूनोस्टेनिंग

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...