Name: enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment
Uploaded: 2019-09-17T15:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Kotaja за их вклад в разработку протокола, а также за активное использование и тестирование протокола в их исследовательских проектах. В частности, мы высоко ценим вклад Яна Линдстрёма в оптимизацию протокола. Это исследование было поддержано Академией Финляндии, Фондом Сигрида Джуселиуса и докторской программой молекулярной медицины Турку.

<ol>
	<li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).</li><li>Lehtiniemi, T., Kotaja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+granule-mediated+RNA+regulation+in+male+germ+cells.">Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells.</a> Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).</li><li>Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).</li><li>Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analyses+of+enriched+populations+of+male+mouse+germ+cells+by+sedimentation+velocity:+the+centrifugal+elutriation.">Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).</li><li>Romrell, L. J., Bellv&#233;, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYCO1+and+autophagy+control+the+integrity+of+the+haploid+male+germ+cell-specific+RNP+granules.">FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules.</a> Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-parameter+flow+cytometric+analysis+of+rat+spermatogenesis.">Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis.</a> Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Представлен простой и недорогой протокол для изоляции обогащенных популяций круглых сперматозоидов, пахитена сперматоцитов и удлиненных сперматозоидов с использованием стандартного лабораторного оборудования (обзор протокола показан на рисунке 4). Хотя нет опыта или дорогостоящего оборудования не требуется, Есть некоторые критические шаги, которые должны быть рассмотрены во время пищеварения тканей, строительство градиента, и загрузка подвески клетки на градиент.
Зародыш клетки высвобождаются из семено-полуплодовые трубки двумя последовательными ферментативными пищеварениями. Первое пищеварение с коллагеназой IV отделяет полуниферные трубки, удаляя интерстициальные клетки. Длительное время пищеварения может повредить трубочки и привести к потере сперматозоидов, так как (если они будут освобождены из труб во время этого шага) они будут отброшены в следующих шагах. Второй шаг пищеварения с трипсином выпускает зародышевые клетки из семеноплодных труб. Там может быть случайные лиза клетки и, как правило, некоторые скопления форме из-за выпустила геномной ДНК. Превышение предлагаемой продолжительности или температуры пищеварения не рекомендуется, так как это может привести к более низкой жизнеспособности, увеличение лиза клеток, и слипания. Если мягкий слипания происходит, сгустки могут быть проигнорированы. Однако, в случаях значительного слипания и потери клеток, время пищеварения трипсина или концентрация должна быть сокращена. Следует также отметить, что ферментативная активность трипсина может варьироваться между партиями и в течение длительного времени хранения. Количество DNase I во время пищеварения трипсина также может быть увеличена, чтобы удалить избыток сгустков, но это следует рассматривать как вторичное решение. Важно получить однородную одноклеточную суспензию в конце предварительной обработки, так как слипшиеся клетки будут отложения быстрее, загрязняя фракции и нарушая градиент.
Создание градиента может потребовать определенной практики. Если есть дискомфорт с помощью 5 мл пипетки отзыв с контроллером пипетки, рекомендуется использовать нормальный 1 мл механических пипетки с гладким поршенем затем сократить пипетка советы к диафрагм ю 3 мм в диаметре(Рисунок 1B). Более широкая диафрагма и плавная загрузка решений BSA уменьшит риск смешивания градиента. При правильной подготовке можно увидеть границы между смежными решениями BSA из-за их различных рефракционных индексов. Градиент должен быть произведен непосредственно перед использованием. Следует также отметить, что любая небольшая встряхивания или вибрации может нарушить градиент, поэтому градиент должен быть установлен в среде, где он не будет нарушен.
Загрузка клеточной подвески на градиент должна быть выполнена очень осторожно. После загрузки клеточная подвеска должна оставаться на верхней части градиента, от которого клетки будут медленно начинать осадки через первый слой. Если большие группы ячеек видны движущиеся быстро через градиент, клетки, скорее всего, не resuspended тщательно или есть избыток слипания. Если клетки не остаются на верхней части прерывистого градиента BSA при загрузке, но сразу же опускаются между слоями 1% и 2% BSA (шаг 3.6), то суспензия клетки, скорее всего, слишком плотная. Этот протокол был оптимизирован с использованием двух яичек взрослой мыши (80-120 мг/тести) в качестве исходного материала; хотя, успешные изоляции с использованием меньшего количества исходного материала было выполнено. Для высококлассного протокола и получения более обогащенных зародышевых клеток из большего количества яичек, более 50 мл труб с градиентом должны быть введены.
Протокол был первоначально разработан и оптимизирован для обогащения гаплоидных круглых сперматозоидов из яичек для взрослых мышей, а чистота круглых сперматозоидов, как ожидается, составит более 90%. В дополнение к очень чистым круглым сперматозоидам были получены удовлетворительные результаты для обогащения сперматозитов пахитена и удлинений сперматозоидов. Следует отметить, что эритроциты могут загрязнять удлинение сперматозоидов, и дальнейшие шаги по их устранению должны быть приняты, если их присутствие, как ожидается, мешает вниз по течению анализов. Мы не смогли обогатить другие типы клеток, такие как премейотические или ранние мейотические клетки (до фазы пахитена) от взрослых мышей, используя протокол MDR.
Кроме того, STA-PUT отложения была успешно использована для получения обогащенных фракций сперматогония или прелептотена, лепоттена и зиготена сперматозитов с использованием ювенильных яичек, собранных в данный тайм-пойнты после рождения13. Этот подход использует появление этих типов клеток во время первой волны сперматогенеза. Такой же подход, вероятно, может применяться к обогащению МЛУ, однако он еще не опробован на практике. Другой метод, который является хорошим вариантом для очистки премейотических и мейотических клеток на определенных стадиях дифференциации является FACS, который имеет важное преимущество, позволяя изоляции конкретных типов клеток на основе присутствия конкретных маркеров14 ,15,16,17.
В целом, осадок скорости МДР служит полезным методом для обогащения зародышевых клеток. Хотя этот метод не превосходит другие устоявшиеся методы с точки зрения чистоты или количества обогащенных клеток, его явными преимуществами являются его простота и низкие затраты на настройку. Это, вместе с низким количеством необходимых исходных материалов, сделать этот протокол отличным вариантом для исследователей в области сперматогенеза и тех, в других областях, которые не хотят инвестировать в специализированное оборудование или большие группы животных.

Многое до сих пор неизвестно о молекулярных и биологических событий, происходящих во время сперматозоидов сперматогенеза, сложный процесс, в котором сперматогоиальные стволовые клетки превращаются в узкоспециализированные сперматозоиды1,2. Сперматогенез происходит внутри семено-полуплодовых трубяков яичка. Трубочки содержат смесь зародышевых клеток с каждого шага дифференциации, включая сперматогольные стволовые клетки, митотически разделяющие сперматого, мейотические сперматозии и постмейотические сперматозоиды (которые проходят гаплоидную дифференциацию от круглых сперматозоидов для удлинения сперматозоидов, и, наконец, созреть сперматозоиды). Соматические клетки яичка включают клетки Sertoli, которые переплетаются с зародышевыми клетками внутри полуниферовых труб, перитубулярных миоидных клеток, которые образуют стенки труб, и тестостерон-производящих клеток Лейдига в интерстициальном пространстве между трубами.
Изучение молекулярных и биохимических процессов во время сперматогенеза часто требует отделения различных популяций зародышевых клеток от сложной смеси яичек. Было разработано много различных стратегий для обогащения клеток. Наиболее успешными методами являются ОСАДОчные отложения скорости STA-PUT единицей гравитации3,4,5,6,центробежная элевация на основе центрифугации противотуманных7,8, и сортировка клеток, активированных флуоресценцией (FACS), которая отделяет клетки в зависимости от содержания ДНК и/или конкретных маркеров. Эти методы широко используются среди исследователей сперматогенеза и позволяют эффективное обогащение конкретных типов зародышевых клеток. Однако ограничение этих методов заключается в том, что они требуют специализированного дорогостоящего оборудования, требуя опыта.
Здесь представлен простой и недорогой протокол для изоляции обогащенных популяций трех наиболее распространенных клеточных популяций мышечных яичек: круглых сперматозоидов, пахитена сперматоцитов и удлиненных сперматозоидов. Этот протокол называют модифицированным градиентом плотности для круглых сперматозоидов (MDR), потому что он особенно хорошо работает для обогащения круглых сперматозоидов. Метод MDR основан на тех же принципах, что и осадок скорости STA-PUT, но требует только стандартного лабораторного оборудования. В стандартных 50 мл трубки под гравитационным полем Земли можно провести отложения через вручную подготовленный прерывистый доблиновый альбумин (BSA) градиент плотности крупного рогатого скота (BSA). Большие клетки движутся быстрее через градиент, который разделяет различные популяции зародышевых клеток. После отложений, обогащенные фракции трех типов клеток собираются вручную. Чистота этих обогащенных популяций клеток сравнима с теми, которые получают STA-PUT и центробежная универсалия.
В дополнение к покрытию конструкции и использования градиента BSA для отложений скорости, протокол также описывает метод пищеварения для того чтобы выпустить яички клетки от seminiferous трубок. Протокол был изменен с того, что разработан Ромрелл и др.9 и включает в себя последовательные пищеварения с коллагеназом IV и трипсином. Последовательное пищеварение в сочетании с использованием буфера бикарбоната (т.е. растворки Кребса) значительно повышает разделение и жизнеспособность зародышевых клеток9.
Во время обогащения МЛУ, клетки проводят около 4 ч вместе вне окружающей среды полуниферных труб и не подвергаются стрессовым механическим силам, что позволяет для сбора высокожизнеспособных клеточных фракций для анализа вниз по течению. Кроме того, подобно центробежной универсации и STA-PUT, протокол MDR не требует какой-либо химической обработки или маркировки клеток, что также помогает поддерживать их жизнеспособность. Важно отметить, что всего лишь два взрослых мычек мыши достаточно для изоляции МДР и, следовательно, одна взрослая мышь обеспечивает достаточно обогащенных клеток для РНК и анализа белка. Стандартный протокол STA-PUT рекомендует использовать целых 12 взрослых мышей для изоляции клеток6; хотя, основываясь на предыдущем опыте, известно, что успешная изоляция может быть сделано от трех до четырех взрослых мышей. Наименьшее количество исходного материала, как сообщается, достаточно для центробежной элутриации шесть мышей яичек (три мыши)8. Поэтому, помимо устранения необходимости в дорогостоящем специализированном оборудовании, протокол МДР сокращает количество необходимых лабораторных животных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>HyTest</td>
			<td>5G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL1</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>G82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL2, clone 13E-3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>for Alexa Fluor immunostainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit IgG</td>
			<td>Neomarkers</td>
			<td>NC-100-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>for standard DAPI analysis of cell fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartolab BT 180C6</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL or 2 ml tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell sieves for 50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td>or equivalent cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture incubator</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge for 50 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen for microscopy glass slides</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>or equivalent cell rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection forcepts</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscopy glass slides and coverslips</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy Acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155 000</td>
			<td>or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips for 1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment

Чтобы охарактеризовать каждый шаг сперматогенеза, исследователи должны отделить различные субпопуляции зародышевых клеток от яичек. Тем не менее, изоляция дискретных популяций является сложной задачей, потому что взрослый яичек содержит сложную смесь зародышевых клеток со всех этапов сперматогенеза вместе с определенными популяциями соматических клеток. За последние несколько десятилетий, различные методы, такие как центробежная элутриация, флуоресценция активированной сортировки клеток (FACS), и STA-PUT были успешно применены к изоляции зародышевых клеток. Недостатком является то, что все они требуют специальных устройств и специализированной подготовки. Следуя принципам, лежащим в основе метода STA-PUT, был разработан простой протокол для изоляции сперматозоидов пахитена, круглых сперматозоидов и удлинений сперматозоидов из яичек мыши. После подготовки одноклеточной суспензии яичек, конкретные популяции клеток обогащаются гравитационным осадочным отложением через прерывистый градиент плотности сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Затем фракции клеток собираются вручную и микроскопически анализируются. Этот модифицированный градиент плотности для круглых сперматозоидов (MDR) протокол осадка может быть широко применен, потому что он требует только стандартного лабораторного оборудования. Кроме того, протокол требует минимальных исходных материалов, снижая его стоимость и использование лабораторных животных.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment at JoVE.com

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

Представлен протокол для обогащения пахитена сперматоцитов, круглых сперматозоидов и удлинение сперматозоидов от взрослых яичек мыши с использованием прерывистой бычьей сыворотки альбумина градиент плотности с стандартным лабораторным оборудованием.

Обогащение сперматозоидов Pachytene и сперматозоидов из мышиных яичек с использованием стандартного лабораторного оборудования

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Простой и недорогой метод, который мы называем MDR позволяет изолировать обогащенные популяции пахитенов сперматозоидов, круглые сперматозоиды и удлиненные сперматозоиды из мышей яички. Основным преимуществом метода MDR является его простота. Вам нужно только стандартное лабораторное оборудование, которое доступно в большинстве биомедицинских исследовательских лабораторий.Протокол MDR отлично подходит для исследователей, которые проводят функциональные исследования мужских зародышевых клеток. Например, группы, изучающие сперматогенез, факторы, влияющие на мужскую плодовитости, а также отцовское эпигенетическое наследование. Для метода MDR требуется минимальный стартовый материал.И в самом деле, мы обычно получаем хорошее количество клеток, используя только один взрослый мужчина мыши. Начните с установки необходимого оборудования и реагентов. Установите ванну для воды до 37 градусов по Цельсию и инкубатор клеточной культуры 34 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа и 95%влажности.Поместите трубчатый ротатор внутри инкубатора. Подготовьте и обозначите соответствующее количество микроскопии стеклянными слайдами, затем нарисуйте кольцо диаметром около одного сантиметра с помощью смазаны ручкой и дайте смазке высохнуть. Когда готовы вскрыть животное, спрей брюшной полости мыши с 70% этанола и использовать ножницы, чтобы сделать V форму открытия в брюшной полости таза.Потяните на эпидидимальной жировой площадке с типсами, найти яички и удалить их ножницами, убедившись, чтобы избежать тревожных туника альбугинеа. Поместите яички на шестиметровую чашку Петри, содержащую 1X KREBS. Decapsulate яички и отказаться от туника альбугинея, а затем слегка разогнать семенные трубочки, осторожно дразнить их друг от друга с типсами.Перенесите их в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую два миллилитров свежеприготовленного раствора коллагеназы. Инкубировать трубоубивания в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение трех минут, агитировать их осторожно, качая. Затем добавьте не менее 40 миллилитров теплого 1X KREBS и дайте трубоубий отложениям при комнатной температуре.Снимите супернатант и повторите стирку еще раз. Добавьте 25 миллилитров свежеприготовленного трипсина раствора. Поместите трубку на ротатор внутри инкубатора клеточной культуры и оставьте ее там на 15-20 минут, вращаясь со 15 об/мин.Время от времени проверяйте трубоубивания. Как только раствор станет мутным и останутся лишь мелкие кусочки трубоубей, поместите трубку на лед и перейти к следующему шагу. Фильтровать раствор через 40-метровый ситечко клеток в новую 50-миллилитровую коническую трубку на льду.Затем центрифуга его на 600 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки. Аккуратно вылейте супернатант и коснитесь клеточной гранулы, чтобы повторно использовать клетки в оставшейся части 1X KREBS. Добавьте не менее 40 миллилитров холодных 1X KREBS в перерасходные клетки и повторите центрифугу.Повторное использование клеток путем нажатия трубки. Затем смонтировать наконечник пипетки на один миллилитр пипетки и сократить его так, что диафрагма составляет около трех миллиметров в диаметре. Добавьте до трех миллилитров 0,5%BSA в KREBS.Resuspend клетки путем pipetting вверх и вниз, убедившись, чтобы избежать пузырьков. Фильтровать подвеску клетки через 40-метровый ситечко и немедленно приступить к загрузке клеток на градиент BSA. Ваш должен получить однородную одноклеточную подвеску перед загрузкой клеток на градиент.Clumped клетки будут осадок быстрее, нарушая ваш градиент и загрязняющих фракций. Установите 50 миллилитровую трубку вертикально на льду, убедившись, что можно увидеть одну сторону трубки. Затем вырезать около пяти до десяти миллиметров от кончика десяти миллилитров серологического пипетки и установить его на контроллер пипетки.Пипетт пять миллилитров раствора 5%BSA в нижней части 50 миллилитров трубки. Аккуратно коснитесь поверхности 5%-го раствора с разрезом кончика пипетки и медленно слой пять миллилитров 4%BSA решение поверх 5%-раствора. Повторите эту процедуру с другими решениями BSA, чтобы получить градиент от 5%до 1%BSA.Между слоями должна быть видна четкая линия. Затем осторожно загрузите одноклеточную подвеску поверх градиента, не нарушая его. Пусть клетки отложений через градиент в течение полутора часов.Используя наконечник выреза пипетки, тщательно соберите одну миллилитровую фракцию в отдельные 1,5 миллилитровые трубки и храните их на льду, убедившись, что про номер труб в порядке, если они были собраны. Центрифуга фракций зародышевых клеток на 600 х г в течение десяти минут при четырех градусах по Цельсию. Затем заботясь, чтобы не беспокоить гранулы, отказаться от большинства супернатантов и повторного перерасхода клеток, щелкая трубки.Добавьте один миллилитр ледяного буфера 1X KREBS к каждой трубке и повторите центрифугу. Отбросьте большую часть супернатанта, оставив около 100 микролитров и тщательно перерасходовать клеточные гранулы. Чтобы проанализировать фракции клеток, начните с пипетки 20 микролитров 4%paraformaldehyde внутри каждого кольца ручки смазки на пронамеренном слайде микроскопии.Немедленно добавьте два микролитров повторно натященных ячеек из соответствующей фракции. Затем высушите горки при комнатной температуре, по крайней мере один час. Промыть слайды один раз с PBS и использовать монтаж среды с DAPI для установки слайдов.Проанализируйте каждый слайд под микроскопом флуоресценции, чтобы оценить, какой именно тип зародышевых клеток обогащается в каждой фракции. После того, как образец из каждой фракции был взят для микроскопии, добавить один миллилитр ледяного 1X KREBS к каждой фракции и центрифуги клетки вниз на 600 до 13000 х г в течение десяти минут при четырех градусах по Цельсию. Удалите и отбросьте супернатант и продолжайте предпочтительный анализ ниже по течению.Этот протокол работает особенно хорошо для обогащения круглых сперматозоидов. Обогащение выше 90% было достигнуто в дробях два, три и четыре. Удлинение сперматозоидов, как правило, остаются на вершине градиента и были собраны с первой фракции.Из-за их больших размеров, пахитен сперматозоиды отложений быстрее и были собраны в прошлом. Обогащение составило около 75% в фракциях 14 и 15. Общая РНК, полученная из большинства фракций, колебалась от 0,5 до 2,5 микрограммов, что достаточно для анализа РНК ниже по течению.Количество белка, полученного из каждой фракции, как правило, варьировалось от 20 до 140 микрограммов, что достаточно для нескольких западных помарк. В этом протоколе 10% белковых лисатов, полученных из одиночных фракций, было достаточно, чтобы четко обнаружить белки DDX4, PIWIL1 и PIWIL2 на стандартной западной помарке. Количество белка в одной фракции было также достаточно для иммунопреципиентации с использованием антитела против PIWIL1, а также для обнаружения coimmunoprecipitated PIWIL2.Даже для первого таймера, этот протокол работает очень хорошо до тех пор, как вы убедитесь, что предварительное лечение ваших клеток хорошо, и ничто не нарушает ваш градиент во время осадка. От одной мыши, вы получаете высокообогащеные клетки, которые могут быть использованы для различных анализов вниз по течению, таких как RT-PCR, РНК секвенирования, иммунопреципиентации и западной blotting. Хотя МЛУ не единственный метод обогащения мужских зародышевых клеток, он является очень удобным инструментом, поскольку он не требует каких-либо специализированных оборудования или обширной подготовки.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Выделение и Обогащение жировой ткани стромальных клеток для расширенной остеогенеза

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Разделительный волосяного фолликула стволовых клеток и кератиноцитов эпидермиса из кожи Спинной мыши

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Роман использования трехмерного УЗИ высокой частоты для ранней беременности характеристика в мышь

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Плода мышь сердечнососудистой визуализации с помощью системы высокой частоты ультразвука (30/45 МГц)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Микроманипуляции хромосом в насекомое Spermatocytes

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...