Name: enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment
Uploaded: 2019-09-17T15:00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i Kotaja Lab för deras bidrag under utvecklingen av protokollet, och den aktiva användningen och testningen av protokollet i deras forskningsprojekt. I synnerhet uppskattar vi bidraget från Jan Lindström för hjälp med att optimera protokollet. Studien stöddes av Finlands Akademi, Sigrid Jusélius stiftelse och Åbo doktorandprogram för molekylär medicin.

Underhållet av laboratoriemöss och alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter för skötsel och användning av försöksdjur.
1. utrustning och Reagensset-up
<ol><li>Ställ vattenbadet till 37 ° c.</li>
	<li>Ställ in cellkulturens inkubator på 34 ° c, 5% CO2, 95% luftfuktighet. Sätt röret rotator inuti inkubatorn. Anmärkning: Inkubatorer kräver lång tid att ändra intern temperatur. Om en inkubator ständigt inställd på 34 ° c inte är tillgänglig, Ställ in en upp 1 dag före experimentet.</li>
	<li>Förbered och märk lämplig mängd mikroskopi glas diabilder. Rita en ring av ~ 1 cm i diameter med en fett penna och låt fettet torka.</li>
	<li>Förbered 1x Krebs buffert, pH 7,8 (tabell 1). Sätt två koniska rör med 50 mL 1x Krebs till 34 ° c för att förvärma för steg 2.5 − 2.8. Förvara resten av 1x Krebs vid 4 ° c eller på is.</li>
	<li>Förbered BSA-lösningar. Förbered först 25 mL 10% (w/v) BSA-lösning i Krebs genom att lösa upp 2,5 g BSA i 1x Krebs-buffert till en slutlig volym på 25 mL. Späd 10% BSA-lösningen med 1x Krebs-buffert för att få olika BSA-koncentrationer (tabell 2). Förvara alla BSA-lösningar vid 4 ° c. Anmärkning: Förbered lösningarna samma dag som proceduren och förvara vid 4 ° c tills användning.</li>
	<li>Bered rötnings enzymerna genom att väga den korrekta mängden trypsin och kollagenas till 50 mL koniska rör (tabell 3).</li>
</ol>2. djurdissektion och beredning av köns cells suspension
Anmärkning: Detta tar cirka 1 h att slutföra.
<ol><li>Offra en vuxen manlig mus (ålder 7 veckor eller äldre, testiklarna väger 80 − 120 mg beroende på stam och ålder) via cervikal dislokation eller co2 kvävning.</li>
	<li>Spraya den ventrala buken av musen med 70% etanol. Öppna abdominopelvic hålighet med sax, vilket gör en V-formad öppning.</li>
	<li>Dra på epididymal fett pad med pinps, lokalisera testiklarna och ta bort dem med sax. Undvik att störa Tunica albuginea. Placera testiklarna på en 6 cm petriskål som innehåller 1x Krebs.</li>
	<li>Decapsulate testiklarna och kasta Tunica albuginea. Lätt skingra de seminihaltiga tubuli genom att försiktigt retas dem isär med pinmupp.</li>
	<li>Använd tång för att överföra de seminihaltiga tubuli till ett 50 mL koniskt rör innehållande 2 mL nyberedd kollagenaslösning (tabell 3).</li>
	<li>Inkubera tubuli i 37 ° c vattenbad i 3 min. agitera försiktigt genom att gunga röret. Anmärkning: Fritt flytande tubuli bör inträffa inom 3 minuter på grund av avlägsnande av interstitiella celler. Den fysiologiska temperaturen för testikelceller är 34 ° c; Därför är långa nedbrytnings vanligtvis sker vid denna temperatur. Emellertid, den korta 3 min matsmältningen kan utföras vid 37 ° c (Rekommenderad temperatur av tillverkaren). Observera att om 34 ° c används bör digestionstiden optimeras igen.</li>
	<li>Tillsätt minst 40 mL varm 1x Krebs och låt tubuli till sediment (~ 1 min) vid rumstemperatur (RT). Ta bort supernatanten och upprepa 1x.</li>
	<li>Tillsätt 25 mL nyberedd trypsinlösning (tabell 3), placera röret på röret rotator inuti 34 ° c inkubator och inkubera i 15 − 20 min (~ 15 rpm). Sporadiskt kontrollera statusen för tubuli. När lösningen blir grumlig och endast små bitar av tubuli kvar, placera röret på isen och omedelbart gå vidare till nästa steg. Anmärkning: För att undvika överrötning och cell Lys, flytta snabbt till följande tvättsteg. Vissa protokoll inkluderar avaktivering av trypsin av fetalt bovint serum (FBS). I detta protokoll, FBS behandling utelämnas, och i stället, trypsin avlägsnas genom omedelbar centrifugering och efterföljande tvättar med kallt 1x Krebs.</li>
	<li>Filtrera lösningen genom en cell SIL på 40 μm till ett nytt 50 mL koniskt rör på isen.</li>
	<li>Centrifugera 600 x g i 5 min vid 4 ° c för att pelleten cellerna. Anmärkning: Centrifugering med för stark kraft kan skada cellerna.</li>
	<li>Ta bort supernatanten genom att noggrant hälla ut den.</li>
	<li>Knacka på cellen pelleten att Omsuspendera cellerna i resten av 1x Krebs.</li>
	<li>Tillsätt minst 40 mL kallt 1x Krebs till de återsuspenderade cellerna.</li>
	<li>Upprepa steg 2,10 och 2,11.</li>
	<li>Knacka på röret med cellpelleten att Omsuspendera cellerna. Tillsätt 1 mL 0,5% BSA i 1x Krebs och med en skuren pipettspets Omsuspendera cellerna genom att Pipettera lösningen uppåt och nedåt. Undvik att göra bubblor.</li>
	<li>Tillsätt slutligen 1 − 3 mL 0,5% BSA i 1x Krebs så att den slutliga volymen är ~ 3 mL. Filtrera bakterie cells suspensionen genom en cellsil på 40 μm och fortsätt omedelbart med att ladda cellerna på BSA-gradienten.</li>
</ol>3. separation av könsceller genom den diskontinuerliga BSA-gradienten
Anmärkning: Det här avsnittet tar cirka 2 timmar att slutföra. Börja förbereda den diskontinuerliga BSA-gradienten under tvätt stegen (steg 2.10 − 2.14) för att ladda cellerna så snart förbehandlingen är klar.
<ol><li>Rymma en 50 mL tub vertikalt på isen så att det är möjligt att se en sida av röret. Alternativt, kör protokollet i ett kallt rum vid 4 ° c, i vilket fall ingen is behövs.</li>
	<li>Skär spetsen på en 10 ml serologiska pipett ca 5 − 10 mm från spetsen för att få en större bländare (figur 1a) och montera den på pipettkontrollen (figur 1C). Anmärkning: Detta kommer att minska hastigheten vid pipettering, vilket underlättar stapling av de olika BSA-lösningarna. Alternativt kan du använda en 1 mL mekanisk pipett med en slät kolv och klippa pipettspetsarna med en bländare på ca 3 mm i diameter (figur 1B).</li>
	<li>Börja med att Pipettera 5 mL 5% BSA-lösning till botten av 50 mL-röret.</li>
	<li>Långsamt Pipettera 5 mL 4% BSA lösning ovanpå 5% lösning. Börja med att försiktigt vidröra ytan på 5%-lösningen med pipettens klippta spets och lager de två lösningarna samtidigt som du noggrant behåller kontakten med ytan, vilket säkerställer att inte Pipettera-spetsen blir nedsänkt. Anmärkning: En tydlig linje ska vara synlig mellan de två lagren i slutet av det här steget.</li>
	<li>Upprepa steg 3,4 med de andra BSA-lösningarna erhåller du en diskontinuerlig lutning från 5% upp till 1% (figur 1D).</li>
	<li>Ladda försiktigt encellig fjädring ovanpå lutningen utan att störa. Låt cellerna sediment genom gradienten för 1,5 h vid 4 ° c eller på is.</li>
</ol>4. insamling av anrikade köns cells fraktioner
Anmärkning: Det här avsnittet tar cirka 30 minuter att slutföra.
<ol><li>Montera en 1 mL pipettspets på en 1 mL mekanisk pipett och skär spetsen så att bländaren är ~ 3 mm i diameter (figur 1B).</li>
	<li>Samla försiktigt in ~ 1 mL fraktioner i separata 1,5 mL-rör, med början från toppen av BSA-gradienten, och förvara dem på isen. Numrera rören i samma ordning som fraktionerna kommer att samlas in. Anmärkning: Vid denna punkt bör det finnas en serie ~ 28 rör som innehåller cellsuspensioner. Använd en 1 mL mekanisk pipett med en slät kolv och skär pipettspetsarna för att minimera risken för att BSA-gradienten störs.</li>
	<li>Centrifugera köns cells fraktioner vid 600 x g i 10 min vid 4 ° c.</li>
	<li>Noga med att inte störa pelleten, kassera de flesta av supernatanten och Omsuspendera cellpelleten genom att snärta röret. Tillsätt 1 mL iskall 1x Krebs buffert till varje rör och upprepa centrifugering. Anmärkning: Upprepa tvättsteget om BSA stör nedströms analys.</li>
	<li>Kassera de flesta av supernatanten men lämna ~ 100 μL efter den sista tvätten. Omsuspendera cellpelleten noggrant. Anmärkning: Omresuspenera cellerna noggrant säkerställer att provet tas från den här lösningen representerar alla celler i den givna fraktionen. Håll cell upphängningarna på isen medan du förbereder bilderna.</li>
</ol>5. analys av cell fraktioner
Anmärkning: Analys tar 2 h för att slutföra.
<ol><li>En i taget, Pipettera 20 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) inuti varje fett penna ringen på en numrerad mikroskopi Slide.</li>
	<li>Tillsätt omedelbart 2 μL av den återsuspenderade cellsuspensionen från motsvarande fraktion. Upprepa för varje bråk. Anmärkning: Håll alla cellsuspensioner på isen medan du förbereder bilder.</li>
	<li>Torka av bilderna vid RT under 1 h till över natten (O/N). Anmärkning: Under det här steget, efter att ha tagit ett prov från varje fraktion, kan cellerna bearbetas för nedströms analyser eller lagring (avsnitt 6).</li>
	<li>Skölj bilderna en gång med 1x PBS och montera med monteringsmedel med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (tabell över material).</li>
	<li>Analysera bilderna under ett fluorescensmikroskop för att uppskatta vilken typ av bakteriecell som är berikad i varje bråk. Anmärkning: Olika celltyper kan kännas igen av deras karakteristiska nukleär morfologi visualiseras av DAPI färgning. Figur 2 A visar representativa fraktioner berikade i vid förlängning spermatider, runda spermatider och testikulär spermatocyter. Den runda spermatidkärnan är liten (6 − 7 μm i diameter) och rund (figur 2a). Mus runda spermatid kärnor kännetecknas också av en enda, Rund Heterokromatin struktur som kallas chromocenter. Kärnor av vid förlängning spermatider har en typisk långsträckt form och minskad kärnkrafts storlek på grund av kromatin kondensation (figur 2a). Pachytene spermatocyte kärnor är mycket större (diameter mer än 10 μm) och mer oregelbunden form, med områden med tätt packade kromatin fördelas i hela (figur 2a).</li>
	<li>
Vid behov utför immunofärgning utöver DAPI-färgning för att stödja erkännandet av de olika celltyperna.
	<ol>
<li>I detta fall, fördela 2 μL cellsuspension med 20 μL av en fixerande lösning (4% PFA och 0,1% nonioniskt ytaktivt ämne i PBS) inuti en fett Penn ring. Efter torkning av diabilder, postfix cellerna med 4% PFA för 10 min vid RT.</li>
		<li>Skölj med PBS, sedan permeabilize med 0,1% icke-jonaktivt tensid i PBS i 5 min. Skölj med PBS och avaktivera eventuella kvarvarande PFA genom inkuberande diabilder i 100 mm NH4cl i 5 min.</li>
		<li>Skölj med PBS och fortsätt till ett standardiserat immunofluorescensprotokoll som består av blockering och inkuberingar med specifika primära antikroppar och fluorkrommärkta sekundära antikroppar. Montera bilderna med AntiFade Mountant med DAPI (tabell över material) och låt dem ställa in för 24 h. Anmärkning: Exempel på användbara markörer för primära antikroppar inkuberingar inkluderar jordnötter kall (PNA; 1:2000 i blockerande lösning) som fläckar acrosome i runda och långlånga spermatider, anti-DDX4 antikropp (1:200 i blockerande lösning) som etiketter en enda cytoplasmiska granule i runda spermatids, och anti-γh2ax antikropp (1:100 i blockerande lösning) som erkänner kön organ i testikulär spermatocyter. Se representativa resultat och figur 2C, D för exempel på immunofluorescensanalys av fraktioner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. behandling av återstående prover för lagring
Anmärkning: Avsnitt 6 tar cirka 20 minuter att slutföra.
<ol><li>När ett prov från varje fraktion har tagits för en mikroskopi bild, tillsätt 1 mL iskalla 1x Krebs till varje fraktion och centrifugera cellerna ner vid 600 − 13000 x g i 10 min vid 4 ° c. Anmärkning: En låg hastighet centrifugering resulterar i en lös pellet, vilket gör det svårt att helt ta bort 1x Krebs, medan en snabb centrifugering kan skada cellerna. Välj centrifugeringshastigheten enligt de särskilda kraven i protokollet nedströms.</li>
	<li>Ta bort och Kassera supernatanten och fortsätt med önskad nedströms analys. Anmärkning: Vid denna punkt, cellerna kan vara Snap-fryst i flytande kväve och lagras vid-70 ° c. När bekant med denna teknik, är det möjligt att fortsätta med nedströms preferens protokollet direkt, men det är alltid klokt att ta ett prov och säkerställa renhet av varje fraktion. Totalt RNA kan extraheras, kvantifieras och analyseras med metoder som omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion (PCR) och RNA-sekvensering. Totalt proteinextrakt kan också framställas från vilken immunoprecipitation eller västerländsk blotting analys kan utföras (figur 3).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).</li><li>Lehtiniemi, T., Kotaja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+granule-mediated+RNA+regulation+in+male+germ+cells.">Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells.</a> Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).</li><li>Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation,+physical+characterization,+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse.">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).</li><li>Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analyses+of+enriched+populations+of+male+mouse+germ+cells+by+sedimentation+velocity:+the+centrifugal+elutriation.">Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).</li><li>Romrell, L. J., Bellv&#233;, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium.">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).</li><li>Da Ros, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYCO1+and+autophagy+control+the+integrity+of+the+haploid+male+germ+cell-specific+RNP+granules.">FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules.</a> Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-parameter+flow+cytometric+analysis+of+rat+spermatogenesis.">Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis.</a> Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Presenteras här är ett enkelt och billigt protokoll för att isolera anrikade populationer av runda spermatider, testikulär spermatocyter, och vid förlängning spermatider med hjälp av standard laboratorieutrustning (översikt av protokollet som visas i figur 4). Även om ingen expertis eller dyr maskin krävs, det finns några kritiska steg som måste beaktas vid vävnadsnedbrytning, byggandet av gradienten, och lastning av cellsuspensionen på gradienten.
Könsceller frigörs från seminihaltiga tubuli av två på varandra följande enzymatiska digestions. Den första matsmältningen med kollagenas från IV separerar seminihaltiga tubuli genom att ta bort interstitiella celler. Långvarig digestionstid kan skada tubuli och leda till förlust av spermatider, som (om frigörs från tubuli under detta steg) de kommer att kasseras i följande steg. Den andra digestionssteget med trypsin frigör könsceller från seminihaltiga tubuli. Det kan finnas enstaka cell Lys och typiskt några klumpar form på grund av utsläppt genomisk DNA. Överskrider den föreslagna varaktigheten eller temperaturen av matsmältningen rekommenderas inte, eftersom detta kan leda till sämre lönsamhet, ökad cell Lys, och klumpar. Om mild klumpar inträffar, kan klumpar ignoreras. Emellertid, i fall av betydande klumpar och förlust av celler, trypsin digestionstid eller koncentration bör minskas. Det bör också noteras att trypsins enzymatiska aktivitet kan variera mellan partier och under långa lagringstider. Mängden DNase jag under trypsin matsmältningen kan också ökas för att ta bort överskott klumpar, men detta bör betraktas som en sekundär lösning. Det är viktigt att få en homogen encellig suspension i slutet av förbehandlingen, eftersom klumpgranulat celler kommer sediment snabbare, kontaminerar fraktioner och störa gradienten.
Att bygga gradienten kan kräva lite övning. Om det finns obehag med en 5 mL pipett spets med en pipett Controller, det rekommenderas att använda en normal 1 mL mekanisk pipett med en slät kolv sedan skära pipetten spetsar till en bländare på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En bredare bländare och smidig lastning av BSA-lösningarna minskar risken för att lutningen blandas. Vid korrekt förberedd, är det möjligt att se gränserna mellan intilliggande BSA lösningar på grund av deras olika brytningsindex. Lutningen ska framställas direkt före användning. Det bör också noteras att eventuella små skakningar eller vibrationer kan störa lutningen, så lutningen bör ställas in i en miljö där det inte kommer att störas.
Lastning av cellsuspensionen på gradienten måste göras mycket noggrant. Efter lastning bör cellsuspensionen stanna på toppen av gradienten, från vilken cellerna sakta kommer att börja sediment genom det första lagret. Om stora grupper av celler ses rör sig snabbt genom gradienten, cellerna var sannolikt inte återsuspenderas försiktigt eller det finns överskott klumpar. Om cellerna inte stannar på toppen av den diskontinuerliga BSA-gradienten vid lastning men omedelbart sjunker mellan 1% och 2% BSA-lager (steg 3,6), är cellsuspensionen sannolikt alltför tät. Detta protokoll har optimerats med hjälp av två testiklarna av en vuxen mus (80-120 mg/testis) som utgångsmaterial; även om framgångsrika isoleringar med reducerade mängder av utgångsmaterial har utförts. För att Uppskala protokollet och få mer berikade könsceller från högre antal testiklarna, bör mer 50 mL rör med gradienten införas.
Protokollet utvecklades ursprungligen och optimerad för att berika haploida runda spermatider från vuxna mus testiklarna, och renhet runda spermatid fraktioner förväntas vara mer än 90%. Förutom mycket ren runda spermatid fraktioner, tillfredsställande resultat för berikning av testikulär spermatocyter och vid förlängning spermatider erhölls. Det bör noteras att erytrocyter kan förora den förlängda spermatid fraktioner, och ytterligare åtgärder för att eliminera dem bör tas om deras närvaro förväntas störa nedströms analyser. Vi har inte kunnat berika andra celltyper såsom premeiotiska eller tidiga meiotiska celler (före testikulär fas) från vuxna möss med hjälp av Mdr-protokollet.
Dessutom, sta-put sedimentering har framgångsrikt använts för att få berikade fraktioner av spermatogonier eller preleptotene, leptotene, och zygotene spermatocyter med juvenila testiklarna samlas vid givna tidpunkter efter födseln13. Denna metod utnyttjar utseendet på dessa celltyper under den första vågen av spermatogenes. Samma tillvägagångssätt kan sannolikt tillämpas på MDR-berikning, men det har ännu inte testats i praktiken. En annan metod som är ett bra alternativ för rening av premeiotiska och meiotiska metafaserna celler vid specifika stadier av differentiering är FACS, som har den viktiga fördelen att tillåta isolering av specifika celler typer baserat på närvaron specifika markörer14 ,15,16,17.
Sammantaget fungerar MDR-hastighetssedimenteringen som en användbar metod för att berika könsceller. Även om denna metod inte är överlägsen andra väletablerade metoder i termer av renhet eller kvantitet av berikade celler, dess tydliga fördelar är dess enkelhet och låga uppsättningskostnader. Detta, tillsammans med den låga mängden nödvändiga utgångsmaterial, göra detta protokoll ett bra alternativ för forskare i spermatogenes fältet och de inom andra områden som kanske inte vill investera i specialiserad hårdvara eller stora grupper av djur.

Mycket är fortfarande okänt om de molekylära och biologiska händelser som äger rum under däggdjurs spermatogenes, en komplicerad process där spermatogoniala stamceller förvandlas till högspecialiserade spermatozoer1,2. Spermatogenes sker inuti sädeskanalerna av testiklarna. Tubuli innehåller en blandning av könsceller från varje steg av differentiering, inklusive spermatogoniala stamceller, mitotiskt dividera spermatogonia, meiotiska spermatocyter, och postmeiotiska spermatider (som genomgår haploida differentiering från runda spermatider till vid förlängning spermatider, och slutligen till mogna spermatozoa). Somatiska celler av testiklarna inkluderar Sertoli celler som blandas med könsceller inne i seminiska tubuli, peritubulär myoid celler som bildar väggarna i tubuli, och testosteron-producerande Leydig celler i interstitiell utrymme mellan tubuli.
Att studera molekylära och biokemiska processer under spermatogenes kräver ofta separation av distinkta köns cells populationer från en komplex blandning av testikelceller. Många olika strategier har utvecklats för cell berikning. De mest framgångsrika metoderna är sta-put Velocity sedimentering av enheten allvar3,4,5,6, centrifugal elutriation baserad på motströms centrifugering7,8, och fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) som separerar celler i enlighet med DNA-innehåll och/eller specifika markörer. Dessa metoder används ofta bland forskare spermatogenes och möjliggöra en effektiv berikning av specifika bakteriecell typer. Men en begränsning av dessa tekniker är att de kräver specialiserad, dyr hårdvara som kräver expertis.
Presenteras här är ett enkelt och billigt protokoll för att isolera berikade populationer av de tre vanligast förekommande cellpopulationer av mus testiklarna: runda spermatids, testikulär spermatocyter, och vid förlängning spermatids. Detta protokoll kallas den modifierade densitetsgradienten för runda spermatider (Mdr), eftersom det fungerar särskilt bra för berikande runda spermatider. MDR-metoden bygger på samma principer som STA-PUT Velocity sedimentation, men det kräver bara standard laboratorieutrustning. Levande celler tillåts sediment genom en manuellt beredd diskontinuerlig bovint serum albumin (BSA) densitet gradient inuti en standard 50 mL rör under jordens gravitationsfält. Större celler rör sig snabbare genom gradienten, som separerar olika populationer av könsceller. Efter sedimentation, anrikad fraktioner av de tre celltyper samlas in manuellt. Renheten hos dessa anrikade cellpopulationer är jämförbar med de som erhålls genom STA-PUT och centrifugal elutriation.
Förutom att täcka konstruktionen och användningen av BSA-gradienten för hastighets sedimentering, beskriver protokollet också en digestionsmetod för att frigöra testikelceller från seminihaltiga tubuli. Protokollet ändrades från det som utvecklades av Romrell et al.9 och omfattar sekventiella digestioner med kollagenas IV och trypsin. Sekventiella digestioner kombinerat med användning av en bikarbonatbuffert (dvs. Krebs-lösningen) har visat sig kraftigt öka separationen och livskraften hos könscellerna9.
Under MDR berikning, celler spenderar runt 4 h tillsammans utanför miljön i seminiösa tubuli och utsätts inte för stressande mekaniska krafter, vilket möjliggör insamling av mycket livskraftiga cellulära fraktioner för nedströms analys. Dessutom, liknande den centrifugal elutriation och STA-PUT, MDR-protokollet inte kräver någon kemisk behandling eller märkning av celler, vilket också bidrar till att bibehålla sin lönsamhet. Viktigare, så lite som två vuxna mus testiklarna är tillräckliga för MDR isolering och därför, en vuxen mus ger tillräckligt berikade celler för både RNA och proteinanalys. Standard STA-PUT-protokollet rekommenderar användning av så många som 12 vuxna möss för cell isolering6; även om, baserat på tidigare erfarenhet, är det känt att framgångsrik isolering kan göras från tre till fyra vuxna möss. Den lägsta mängden utgångsmaterial rapporteras vara tillräcklig för centrifugal elutriation är sex mus testiklarna (tre möss)8. Därför, förutom att eliminera behovet av dyr specialiserad utrustning, MDR-protokollet minskar antalet försöksdjur som krävs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836145001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>HyTest</td>
			<td>5G4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-mouse IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-linked anti-rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA protein assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL1</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>G82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIWIL2, clone 13E-3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36962</td>
			<td>for Alexa Fluor immunostainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit IgG</td>
			<td>Neomarkers</td>
			<td>NC-100-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIsure</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>for standard DAPI analysis of cell fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;H2AX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Sartolab BT 180C6</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL or 2 ml tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell sieves for 50 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>542040</td>
			<td>or equivalent cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture incubator</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge for 50 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen for microscopy glass slides</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15920D</td>
			<td>or equivalent cell rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection forcepts</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdissection scissors</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscopy glass slides and coverslips</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy Acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155 000</td>
			<td>or equivalent pipette controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tips for 1 ml mechanical pipette</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Preference of researcher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of pachytene spermatocytes and spermatids from mouse testes using standard laboratory equipment

För att karakterisera varje steg av spermatogenes, måste forskarna separera olika subpopulationer av könsceller från testiklarna. Att isolera diskreta populationer är dock utmanande, eftersom de vuxna testiklarna innehåller en komplex blandning av könsceller från alla steg i spermatogenes tillsammans med vissa populationer av somatiska celler. Under de senaste decennierna, olika tekniker såsom centrifugalelutriation, fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), och STA-PUT har framgångsrikt tillämpats på isoleringen av könsceller. En nackdel är att de alla kräver dedikerade enheter och specialiserad utbildning. Följande principer som ligger till grund för sta-PUT-metoden, ett enkelt protokoll har utvecklats för isolering av testikulär spermatocyter, runda spermatider, och vid förlängning spermatider från mus testiklarna. Efter beredning av en enda cellsuspension av testikelceller, särskilda cellpopulationer berikas av gravitationen sedimentering genom en diskontinuerlig bovint serum albumin (BSA) densitet gradient. Cell fraktionerna samlas sedan in manuellt och analyseras mikroskopiskt. Denna modifierade densitet gradient för runda spermatider (Mdr) sedimentering protokollet kan tillämpas i stor utsträckning, eftersom det kräver endast standard laboratorieutrustning. Dessutom kräver protokollet minimala utgångsmaterial, vilket minskar dess kostnader och användning av försöksdjur.

Tillräcklig berikning av en köns cells typ anses vanligen vara över 80%6. MDR-protokollet fungerar särskilt väl för berikande runda spermatids. Ett stort antal > 90% ren runda spermatider kan rutinmässigt erhållas med hjälp av denna teknik. Optimala fraktioner av testikulär spermatocyter och vid förlängning spermatider är berikade till ~ 75% och ~ 80%, respektive. Elongating spermatider tenderar att stanna ovanpå lutningen och samlas med den första fraktionen. I exemplet som visas innehöll fraktion 1 ~ 80% av vid förlängning spermatider (figur 2B). De flesta vid förlängning spermatider erhållits med denna teknik har kondenserade kärnor, medan icke-kondenserad tidig långsmala spermatider är knappa (figur 2A). Följande fraktioner innehåller berikade runda spermatids. I exemplet var berikningen av runda spermatider mer än 90% i fraktioner 2, 3 och 4, och berikning över 80% sågs helt i sju fraktioner (2 − 8) (figur 2B). På grund av sin stora storlek, testikulär spermatocyter sediment snabbare och samlas sista. I renings exemplet var anrikningen cirka 75% i fraktioner 14 och 15 (figur 2B).
Medan nukleär morfologi, visualiseras av DAPI färgning, oftast räcker för att erkänna cellerna, kan immunofluorescensanalys utföras för att stödja analysen. PNA fläckar utveckla acrosomes av runda och långsamhet spermatider, och acrosomal utseende kan utnyttjas för att ytterligare kategorisera runda spermatider i steg 1 − 8 av differentiering10. Särskiljande PNA-färgade vid förlängning och runda spermatider förlitar sig på skillnaderna i deras nukleära form (figur 2C, vänster panel). Anti-DDX4 antikropp är en användbar markör för den runda spermatid fraktioner eftersom det visualiserar en enda DDX4 positiva perinukleära granule, den chromatoid kroppen (CB), i cytoplasman i varje runda spermatid. Denna CB-specifik färgning är lätt att skilja från mer spridda cytoplasmiska färgning i spermatocyter (figur 2C, mellersta panelen). Testikulär spermatocyter kan kännas igen av anti-γh2ax antikropp som etiketter den nukleära kön kroppen specifikt visas på testikulär fasen av den första meiotiska metafaserna Division (figur 2C, höger panel). I denna rening, PNA färgning visade att Mdr berikade runda spermatid fraktioner innehöll en blandning av runda spermatider vid olika steg av differentiering, alla som innehåller deras signatur struktur, den DDX4-positiva CB (figur 2D, RS-fraktionen). Anti-γh2ax ytterligare validerade anrikningen testikulär spermatocyter i fraktion 16 (figur 2D, pspc fraktion).
Cellen räknar avslöjade att antalet celler i rundan spermatid och testikulär spermatocyte fraktioner är tillräckliga för olika nedströms analyser. Runda spermatidfraktioner (5 − 8) var och en innehöll omkring 2,5 x 106 celler. Därför, genom att samla dessa fraktioner, är det möjligt att få mer än 10 000 000 celler. Pachytene spermatocyte fraktioner (14 och 15) vanligtvis innehöll något färre celler. I denna isolering räknades omkring 1,5 − 2,0 x 106 celler per fraktion. Den första fraktionen innehöll 0,75 x 106 vid förlängning spermatids.
Som framgår av figur 3Avarierade det totala RNA-beloppet från majoriteten av fraktionerna från 0,5 − 2,5 μg, vilket är tillräckligt för efterföljande RNA-analyser såsom omvänd TRANSKRIPTION PCR, RNA-sekvensering, eller visualisering av RNA på en gel. Mängden protein som erhålls från varje fraktion varierar vanligtvis från 20 − 140 μg (figur 3B), vilket är tillräckligt för flera västerländska blots. Hela cellen celllysat utarbetades från insamlade fraktioner, och Western blot analys utfördes med hjälp av antikroppar upptäcka DDX4, PIWIL1, och PIWIL2, som alla är mycket uttrycks i testikulär spermatocyter och runda spermatider samt ubiquitously uttryckt glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH).
I detta protokoll var 10% av de protein lysaterna som härrör från enstaka fraktioner tillräckliga för att tydligt upptäcka alla dessa proteiner på en standard inställning av Western blot (figur 3C). Mängden protein i en fraktion visade sig också vara tillräcklig för immunoprecipitation med hjälp av en antikropp mot PIWIL1, samt för detektion av co-immunoprecipitated PIWIL2 (figur 3D). Dessutom har detta protokoll framgångsrikt använts för att erhålla berikade fraktioner av testikulär spermatocyter och runda spermatider från kontroll och genetiskt modifierade möss för nedströms tillämpningar såsom kvantitativ omvänd Transkription PCR11 och hög genomströmning RNA-sekvensering12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60271/60271fig1.jpg"> Figur 1: beredning av en icke-kontinuerlig BSA-gradient. Aen5 ml serologisk pipettspets för beredning av gradienten. Ben 1 ml pipett spets för beredning av gradienten och insamling av köns cells fraktioner efter sedimentation. C) den utrustning som behövs för att förbereda lutningen. Dlateral visning av den DISKONTINUERLIGA BSA-densitetsgradienten från 5% (nederst) till 1% (topp) BSA-lösning. de 2% och 4% BSA lösningar är blå i färg för bättre visualisering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60271/60271fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60271/60271fig2.jpg"> Figur 2: representativa bilder av de insamlade cell fraktionerna och anriknings analysen. (A) DAPI-färgade testikelceller. Den övre raden visar testiklarna celler i intakt seminiferi epitel av en PFA-fast, paraffin-inbäddade testiklarna avsnitt (vänster) eller i suspension (höger). Den nedre raden visar fraktioner av berikade långlånga spermatider (ES), runda spermatider (RS), eller testikulär spermatocyter (pspc). Skalstreck = 20 μm för den övre raden och 10 μm för inlagringar i den undre raden. B) relativ kvantifiering av de olika köns cells typerna i varje fraktion. Celler räknades manuellt med hjälp av ImageJ-programvaran och klassificerades i RS, ES, PSpc, Sertoli-celler och andra celler. Bråk talen och respektive procent av BSA i gradienten anges på x-axeln. C) immunofluorescensanalys av testikelceller. Vänster panel: rhodamine-märkt PNA fläckar acrosome i båda ES (gula pilen) och RS (vit pil). Mellersta panelen: DDX4 antikropp fläckar en enda perinukleära granule i RS, som är lätt att skilja från den mer diffusa cytoplasmiska signalen i spermatocyter (blå pil). Ingen DDX4-signal detekteras i ES (orange pil). Höger panel: γh2ax antikropp erkänner den karakteristiska nukleära kön kroppen närvarande endast i testikulär spermatocyter (γh2ax-negativa celler markerade med en vit asterisk). Skalstreck = 10 μm. (D) Mdr-anrikade cell fraktioner har märkts med PNA (RS-fraktion), anti-DDX4 (RS-fraktion) och anti-γH2AX (pspc-fraktion) för att ytterligare validera cell berikningen i varje fraktion. Skalstreck = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60271/60271fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60271/60271fig3.jpg"> Figur 3: analyser nedströms efter Mdr-cellberikning. (A) RNA extraherades från varje fraktion efter en representativ Mdr-cellberikning och kvantifierades. Bråk talen och respektive procent av BSA i gradienten anges på x-axeln. B) proteiner extraherades från varje fraktion genom att lysera cellpelleten i Ripa-bufferten (radioimmunoprecipitation assay) och kvantifierades därefter. Chela cell proteinextrakt bereddes och analyserades av Western blotting med antikroppar mot DDX4, PIWIL1, PIWIL2 och GAPDH. 10% av lysatet lästes in från varje angivet bråk. D) immunoprecipitation utfördes från indikerade fraktioner med hjälp av anti-PIWIL1 följt av Western blotting med anti-PIWIL1 och anti-PIWIL2 antikroppar. Det ingående provet innehåller en blandning av protein celllysat från olika fraktioner, och kontroll immunoprecipitation (IP) med kanin IgG utfördes också från en blandad lysate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60271/60271fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60271/60271fig4.jpg"> Figur 4: schematisk representation av Mdr-protokoll och tid som krävs för att slutföra varje steg. Utgångsmaterialet består av två testiklarna från en vuxen mus. Det genomsnittliga antalet celler och mängden RNA och protein som erhålls från en fraktion anges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60271/60271fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Buffert</td>
			<td>Reagenser</td>
			<td>Förberedelse</td>
			<td>Lagring</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Krebs buffert (10X)</td>
			<td>3,26 g KH2Po4
</td>
			<td rowspan="6">Ta till 2 L med H2O, filtrera 0,22 μm och autoklav.</td>
			<td rowspan="6">Kan förvaras vid 4 ° c i flera månader</td>
		</tr>
<tr>
<td>139,5 g NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5,89 g MgSO4 •7h2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 g dextros</td>
		</tr>
<tr>
<td>3,78 g CaCl2•2H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,12 g KCl</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Krebs buffert (1x)</td>
			<td>4,24 g NaHCO3
</td>
			<td rowspan="2">Lös upp NaHCO3 till 100 ml h2o, tillsätt 200 ml 10X Krebs buffert, och ta till 2 L med H2o.</td>
			<td rowspan="2">Att vara beredd färsk</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 mL 10X Krebs buffert</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: beredning av Krebs-buffert.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Koncentration av BSA (w/v)</td>
			<td>10% BSA-lösning</td>
			<td>1x Krebs buffert</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,50%</td>
			<td>0,5 mL</td>
			<td>9,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>9 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>7 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: beredning av BSA-lösningar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Rötnings lösning</td>
			<td>Arbets koncentration</td>
			<td>Reagenser</td>
			<td>Förberedelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenas från</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>Kollagenas IV</td>
			<td>Väg 2 mg kollagenase IV till ett 50 mL koniskt rör och tillsätt 2 mL varm 1x Krebs-buffert precis före matsmältningen (steg 2,3).</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
			<td>0,6 mg/mL</td>
			<td>Trypsin</td>
			<td rowspan="2">Väg 15 mg trypsin till ett 50 mL koniskt rör och tillsätt 25 mL varm 1x KREBS-buffert och 40 μL DNase I precis före matsmältningen (steg 2,6).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>> 3,2 ku/mL</td>
			<td>DNase I</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: beredning av rötnings enzymerna.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment at JoVE.com

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

Presenteras här är ett protokoll för berikande testikulär spermatocyter, runda spermatider, och vid förlängning spermatider från vuxna mus testiklarna med en diskontinuerlig bovint serum albumin densitet gradient med standard laboratorieutrustning.

Berikning av Pachytene spermatocyter och spermatider från mus testiklarna med standard laboratorieutrustning

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Den enkla och billiga metod som vi kallar MDR kan du isolera berikade populationer av pachytene spermatocyter, runda spermatider och töjande spermatider från mustestes. Den största fördelen med MDR-metoden är dess enkelhet. Du behöver endast standard laboratorium utrustning som finns i de flesta biomedicinska forskningslaboratorier.MDR-protokollet är bra för forskare som gör funktionella studier på manliga könsceller. Till exempel grupper som studerar spermatogenes, faktorer som påverkar manlig fertilitet, samt faderliga epigenetiska arv. Minimalt utgångsmaterial krävs för MDR-metoden.Och i själva verket får vi rutinmässigt bra mängd celler med bara en vuxen manlig mus. Börja med att ställa in nödvändig utrustning och reagens. Ställ ett vattenbad till 37 grader Celsius och en cellkultur inkubator 34 grader Celsius, 5%koldioxid och 95%luftfuktighet.Placera en rörrotator inuti inkubatorn. Förbered och märk lämplig mängd mikroskopiglas, rita sedan en ring på cirka en centimeter i diameter med en fettpenna och låt fettet torka. När du är redo att dissekera djuret, spraya den ventrala buken av musen med 70%etanol och använd sax för att göra en V-formöppning i buken bäckenhålan.Dra på epididymal fett pad med tänja, lokalisera testiklingarna och ta bort dem med sax, se till att undvika att störa tunica albuginea. Placera testikorna på en sex centimeter Petriskål som innehåller 1X KREBS. Kapsla in testiklarna och kasta tunica albuginea, sedan något skingra seminiferous tubuli genom att försiktigt retas isär dem med tänjningar.Överför dem till ett koniskt rör på 50 milliliter som innehåller två milliliter nyberedd kollagenaslösning. Inkubera tubuli i 37 grader Celsius vattenbad i tre minuter, agiterar dem försiktigt genom att gunga. Tillsätt sedan minst 40 milliliter varmt 1X KREBS och låt tubulina sedimentera vid rumstemperatur.Ta bort supernatanten och upprepa tvätten en gång till. Tillsätt 25 milliliter nyberedd trypsinlösning. Placera röret på rotatorn inuti cellodlingen inkubator, och lämna det där i 15 till 20 minuter, roterande vid cirka 15 rpm.Sporadiskt kontrollera tubuli. När lösningen blir grumlig och endast små bitar av tubuli kvar, placera röret på is och fortsätt till nästa steg. Filtrera lösningen genom en 40 mikrometercellsil till ett nytt koniskt rör på 50 milliliter på is.Sedan centrifugera den på 600 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius för att pelleta cellerna. Häll försiktigt ut supernatanten och knacka cellpelletsen för att återanvända cellerna i återstoden av 1X KREBS. Tillsätt minst 40 milliliter kall 1X KREBS till de återsuspenderade cellerna och upprepa centrifugeringen.Resuspend cellerna genom att knacka på röret. Montera sedan en pipettspets på en en milliliterpipett och skär den så att bländaren är cirka tre millimeter i diameter. Lägg till upp till tre milliliter på 0,5%BSA i KREBS.Resuspend cellerna genom pipettering upp och ner, se till att undvika bubblor. Filtrera cellupphängningen genom en 40 mikrometersil och fortsätt omedelbart till att ladda cellerna på BSA-gradienten. Din måste erhålla en homogen enda cell suspension innan du laddar cellerna på toning.Klumpade celler kommer sediment snabbare, störa din gradient och förorena fraktionerna. Ställ upp ett 50 milliliter rör vertikalt på is, se till att det är möjligt att se ena sidan av röret. Skär sedan cirka fem till tio millimeter från spetsen på en tio milliliter serologisk pipett och montera den på en pipett styrenhet.Pipett fem milliliter av 5%BSA lösningen i botten av 50 milliliter röret. Rör försiktigt ytan på 5%-lösningen med den skurna spetsen på pipetten och lager fem milliliter långsamt med 4%BSA-lösning ovanpå 5%-lösningen. Upprepa proceduren med andra BSA-lösningar för att få en övertoning på 5%till 1%BSA.En tydlig linje ska vara synlig mellan lagren. Ladda sedan försiktigt den enda cellupphängningen ovanpå övertoningen utan att störa den. Låt cellerna sedimentera genom gradienten i en och en halv timme.Med hjälp av en skurna pipettspets, samla försiktigt en milliliter fraktioner i separata 1,5 milliliter rör och lagra dem på is, se till att numrera rören i den ordning som de samlades in. Centrifugera könscellsfraktionerna vid 600 x g i tio minuter vid fyra grader Celsius. Sedan noga med att inte störa pelleten, kasta de flesta av supernatant och resuspend cellerna genom att snärta röret.Tillsätt en milliliter iskall 1X KREBS buffert till varje rör och upprepa centrifugeringen. Kasta de flesta av supernatanten och lämna cirka 100 mikroliter och resuspend cellpelletsen försiktigt. För att analysera cellfraktionerna, börja med att pipettera 20 mikroliter av 4%paraformaldehyd inuti varje fettpennas ring på en numrerad mikroskopislida.Lägg omedelbart till två mikroliter av de återanvända cellerna från motsvarande fraktion. Torka sedan rutschkanorna i rumstemperatur i minst en timme. Skölj objektglasen en gång med PBS och använd ett monteringsmedium tillsammans med DAPI för att montera objektglasen.Analysera varje objektglas under fluorescensmikroskop för att uppskatta vilken särskild könscellstyp som är berikad i varje fraktion. När ett prov från varje fraktion har tagits för mikroskopi, tillsätt en milliliter iskall 1X KREBS till varje fraktion och centrifug cellerna ner på 600 till 13000 x g i tio minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort och kassera supernatanten och fortsätt med den föredragna analysen nedströms.Detta protokoll fungerar särskilt bra för att berika runda spermatider. Anrikning över 90% uppnåddes i fraktioner två, tre och fyra. Avlånga spermatider tenderar att stanna på toppen av lutningen och samlades in med den första fraktionen.På grund av deras stora storlek, pachytene spermatocyter sediment snabbare och samlades sist. Berikningen var omkring 75%i fraktionerna 14 och 15. Den totala RNA erhålls från majoriteten av fraktioner varierade från 0,5 till 2,5 mikrogram, tillräckligt för nedströms RNA analyser.Mängden protein som erhålls från varje fraktion varierade vanligtvis från 20 till 140 mikrogram, vilket är tillräckligt för flera västerländska blottor. I detta protokoll var 10%av proteinet lysates härrör från enstaka fraktioner tillräckligt för att tydligt upptäcka DDX4, PIWIL1 och PIWIL2 proteiner på en standard Western blot. Mängden protein i en fraktion var också tillräcklig för immunoprecipitation med hjälp av en antikropp mot PIWIL1 samt för påvisande av coimmunoprecipitated PIWIL2.Även för en första timer fungerar detta protokoll mycket bra så länge du ser till att förbehandlingen av dina celler är bra, och ingenting stör din gradient under sedimenteringen. Från en enda mus får du högberikade celler, som kan användas för olika nedströmsanalyser som RT-PCR, RNA-sekvensering, immunoprecipitation och Western blotting. Medan MDR är inte den enda metoden för att berika manliga könsceller, är det ett mycket bekvämt verktyg eftersom det inte kräver några specialiserade utrustningar eller omfattande utbildning.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Isolering och anrikning av humant Fett-stromala celler för Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Använda Isolerad Mitokondrier från minimala kvantiteter av mus skelettmuskulatur för hög genomströmning Mikroandnings Mätningar

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Steg-specifik Sortering av mus spermatider med flödescytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolera stamceller i hudens hårsäckar och epidermal keratinocyter från Dorsal mushud

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Inducerade pluripotenta stamceller Generation från blodkroppar med användning Sendai virus och centrifugering

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

En ny användning av tredimensionella högfrekvent ultraljud för tidig graviditet karakterisering i musen

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Fostrets mus hjärt Imaging använder ett högfrekvent ultraljud (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

Mikromanipulation kromosomer i insekt spermatocyter

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...