Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

نود أن نشكر البروفيسور كريس جونز على مساهمته بخط الهاتف KNS42. وZEiss LSM880 المجهر البؤري مع AiryScan المستخدمة في هذا العمل هو جزء من مشروع هادرسفيلد للابتكار والحضانة (HIIP) الممولة من خلال اتفاق النمو شراكة المشاريع منطقة مدينة ليدز (LEP). الائتمان لصورة المجهر الشكل 3: كارل زايس مجهرية GmbH، microscopy@zeiss.com.

1. توليد من Spheroids الخلية
اليوم الأول
<ol><li>إعداد وسط الثقافة القياسية كما هو مطلوب من قبل خط الخلية قيد التحقيق.</li>
	<li>تنفيذ جميع الخطوات المرتبطة بزراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنيات المناولة المعقمة.</li>
	<li>التجرب وحساب الخلايا السرطان?...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

يتم وصف طريقة جديدة لخلق spheroids الخلايا السرطانية لتحديد نشاط المخدرات migrastatic باستخدام الفحص المجهري البؤري عالية الدقة. وقد سهل استخدام لوحات منخفضة الالتزام على تقنيات أخرى، مثل قطرات شنقا15،وسيلة لتوليد spheroids قابلة للاستنساخ وموحدة لاستخدامها في هجرة الكولاجين وتجارب الغز...

ويتزايد تفضيل التكنولوجيات الثلاثية الأبعاد لاكتشاف المخدرات قبل السريرية وتطوير أدوية السرطان المحتملة على شاشات الأدوية التقليدية؛ وبالتالي، هناك المزيد من التنمية من migrastatic - الهجرة ومنع الغزو - المخدرات. الأساس المنطقي وراء هذه التطورات في علاج السرطان واضحة: 3D sheroid الاختبارات تمثل نهجا أكثر واقعية لفحص الأدوية المضادة للسرطان المحتملة لأنها تحاكي الهندسة المعمارية الورم 3D أكثر إخلاصا من الثقافات الخلية أحادية الطبقة، تلخيص التفاعلات بين المخدرات والورم (الحركية) بشكل أكثر دقة، والسماح بتوصيف نشاط الدواء في بيئة ذات صلة الورم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع مقاومة الأدوية السامة للسموم الكيميائية في العديد من أنواع السرطان وارتفاع معدلات الوفيات بين مرضى السرطان بسبب الانبثاث القوى من خلال قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة إلى مواقع الورم البعيدة يدعم إدراج عوامل العلاج الكيميائي استهداف إمكانات الهجرة من الخلايا السرطانية كعلاج مساعد في تجارب السرطان السريرية في المستقبل1. وهذا هو الحال بشكل خاص في السرطانات الغازية للغاية، مثل الأورام الدبقية عالية الجودة (GBM). تشمل إدارة GBM الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك، حتى مع الجمع بين العلاج، فإن معظم المرضى الانتكاس في غضون 1 سنة من التشخيص الأولي مع البقاء على قيد الحياة متوسط من 11-15 شهرا2،3. وقد أحرز تقدم كبير في مجال التكنولوجيا 3D على مدى السنوات القليلة الماضية: نظم دوارة، وهياكل مجهقلة والسقالات 3D، ويجري تحسين الاختبارات الفردية الأخرى باستمرار للسماح بإجراء اختبارات روتينية على نطاق واسع4، 5و6و7. ومع ذلك، يجب تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الاختبارات بطريقة مجدية لأن تفسير البيانات غالباً ما يعوقه محاولات تحليل البيانات التي تم إنشاؤها ثلاثية الأبعاد مع أنظمة تحليل الصور ثلاثية الأبعاد.
وعلى الرغم من أن معظم النظم الواسعة النطاق لا تزال محدودة بموجب القرار8،على الرغم من أنها أفضل من حيث سرعة الحصول على الصور وانخفاض سمية الصورة. وهكذا، وبصرف النظر عن البيانات قراءة الخروج المتعلقة بفعالية المخدرات، والآثار التفصيلية للعمل المخدرات على الهياكل الخلوية 3D من الخلايا المهاجرة تضيع حتما إذا تم تصويرها باستخدام نظام واسع المجال. وعلى العكس من ذلك، يلتقط الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر (CLSM) صورًا عالية الجودة ومقطعة بصريًا يمكن إعادة بنائها وتقديمها في مرحلة ما بعد الاكتساب ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج الكمبيوتر. وهكذا، فإن CLSM ينطبق بسهولة على الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد المعقدة التصويرية، مما يتيح التحقيق في آثار مثبطات مضادة للميثاستاتيك على الهياكل ثلاثية الأبعاد والتحليلات المتعمقة لآليات هجرة الخلايا. ومما لا شك فيه أن هذا سيوجه تطوير العقاقير الميجراستاتيكية في المستقبل. هنا، يتم وصف سير العمل مجتمعة من جيل spheroid، والعلاج من المخدرات، بروتوكول تلطيخ، والتوصيف عن طريق الفحص المجهري البؤري عالية الدقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

ويتزايد الاستناد إلى اكتشاف المخدرات وتطويرها في بحوث السرطان على شاشات المخدرات في شكل ثلاثي الأبعاد. ويجري اكتشاف مثبطات جديدة تستهدف إمكانات الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية، وبالتالي الانتشار النقيلي للمرض، وتعتبر علاجات تكميلية في أنواع السرطان الشديدة التوغل مثل الأورام الدبقية. وبالتالي، فإن توليد البيانات التي تمكن من إجراء تحليلات مفصلة للخلايا في بيئة ثلاثية الجوانب بعد إضافة دواء مطلوب. المنهجية الموصوفة هنا، التي تجمع بين اختبار غزو البشيرويد والتقاط الصور عالية الدقة وتحليل البيانات عن طريق الفحص المجهري المسح الضوئي بالليزر (CLSM)، مكنت من توصيف مفصل لآثار مثبطات مكافحة الهجرة المحتملة MI-192 على خلايا الورم الدبقي. تم إنشاء Spheroids من خطوط الخلايا لتجارب الغزو في لوحات 96 جيدا الالتزام منخفضة ومن ثم أعدت لتحليل CLSM. وقد تم تفضيل سير العمل الموصوف على تقنيات أخرى شائعة الاستخدام لتوليد السفيرويد بسبب سهولة واستنساخ. هذا، جنبا إلى جنب مع دقة الصورة المحسنة التي تم تحقيقها عن طريق الفحص المجهري البؤري مقارنة مع النهج التقليدية واسعة المجال، سمح بتحديد وتحليل التغيرات المورفولوجية المتميزة في الخلايا المهاجرة في بيئة ثلاثية الأبعاد بعد العلاج مع المخدرات mi-192 mi.

تعمل تقنية spheroid ثلاثية الأبعاد على تعزيز فهم التفاعلات بين المخدرات والورم لأنها أكثر تمثيلاً للبيئة الخاصة بالسرطان. ويمكن تحقيق جيل من spheroids في عدة طرق. تم استخدام لوحات 96 جيدا منخفضة في هذا البروتوكول. بعد اختبار العديد من المنتجات من مختلف الشركات المصنعة، تم اختيار ?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

تتميز آثار مثبطات الميغراستاتيك على هجرة الخلايا السرطانية في اختبار الغزو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) باستخدام مثبطات الأسيتيليلاز الهيستون (HDAC) بالفحص المجهري البؤري عالي الدقة.

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

هذا البروتوكول هو إثبات أننا يمكن الآن تحديد تأثير مثبطات الميغراتية بالتفصيل في نماذج السرطان 3D. الميزة الرئيسية هي السهولة والنهج الكل في واحد التي يمكن تنفيذ هذه التقنية. تسمح هذه التقنية بتقييم الأدوية الميغراتستية في أبحاث السرطان في بيئة ثلاثية الأبعاد ، مما يسمح باختبار الأدوية في بيئة أكثر ملاءمة للورم.ويمكن تطبيق هذه الطريقة على اختبار العقاقير السامة للخلايا في السرطان، أو، على سبيل المثال، لتقييم أثر الإشعاع على انتشار السرطان وهجرة الخلايا. من المفيد ممارسة خطوة الإزالة المتوسطة واستبدال الكولاجين مع لوحات 96-well العادية لتصبح واثقة. أيضا، التدريب على المجهر confocal أمر ضروري.إن العرض المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية بالنسبة للباحثين لفهم المعالجة الدقيقة المطلوبة للـ spheroids واستخدامها في المجهر confocal. في اليوم الأول من التجريب، لديك متوسطة الثقافة القياسية، في هذه الحالة، U251، جاهزة لخط الخلية المناسبة. في غطاء لثقافة الأنسجة، إضافة 0.5 ملليلتر من التربسين في الثقافة ل تريبسينيزي الخلايا السرطانية.عد الخلايا السرطانية على مقياس الهيموسيت، وتمييع تركيز خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة لكل ملليلتر. الحفاظ على تعليق الخلية في أنابيب عالمية مسمّاة بوضوح. إعادة تعليق الخلايا عن طريق عكس لطيف لتجنب تكتل الخلايا.استخدام ماصة لإضافة 200 ميكرولترات من ثقافة الخلية إلى كل بئر في لوحة 96-جيدا. أضف 200 ميكرولترات من 1X PBS إلى كل بئر فارغ لتجنب التبخر. احتضان الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية.بعد 24 ساعة، تحقق من الخلايا عن طريق المجهر مشرق المجال. خطوط الخلية مثل خطوط الخلايا السرطانية جليوما تشكيل spheroids في الجزء السفلي من البئر في غضون 24 ساعة. احتضان spheroids لمدة 48 ساعة أخرى للسماح للهندسة الخلوية 3D لتشكيل.في اليوم الثالث، ضع الكولاجين، متوسط الثقافة 5X، هيدروكسيد الصوديوم واحد المولر، وأنبوب واحد 20 ملليلتر على الجليد. بعناية وببطء إضافة 10.4 ملليلتر من الكولاجين البارد في أنبوب الثقافة المبردة. تجنب الفقاعات.ثم، إضافة بلطف 1.52 ملليلتر من الباردة معقم 5X ثقافة المتوسطة. تجنب الفقاعات. قبل الاستخدام فقط، أضف بلطف 72 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم المبرد المعقم، والحفاظ على المحلل على الجليد.مزيج بلطف عن طريق الأنابيب وتجنب فقاعات. يؤدي الخلط الفعال إلى تغيير اللون من الأحمر إلى اللون البرتقالي والأحمر في الوسط. اترك الخليط على الجليد حتى الاستخدام.بعد ذلك ، لإزالة 190 ميكرولترات من السوبر من لوحة 96 جيدا أعدت في اليوم الأول ، واستخدام ماصة في زاوية نحو جانب البئر. كن حذرا جداً عدم إزعاج spheroids التي تشكلت في الجزء السفلي من البئر. أضف بلطف 100 ميكرولترات من مزيج الكولاجين إلى كل بئر ، وينطّط أسفل جانب البئر.تجنب الفقاعات وأي اضطراب كروي. احتفظ بأي مزيج كولاجين متبقي في أنبوب 20 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة لتقييم البلمرة. احتضان لوحة في الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح للكولاجين البلمرة.عندما يصبح بقايا الكولاجين شبه مُجَمَّدًا ويشبه الإسفنج ، تكون الـ spheroids جاهزة للعلاج بالمثبط. إضافة مثبطات في تركيز 2X إلى خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة. Pipette 100 ميكرولترات من المتوسطة بلطف أسفل الجانب من كل بئر لتجنب اضطراب spheroid.مراقبة وصورة كل spheroid عن طريق المجهر حقل مشرق في أوقات ساعة الصفر، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة لتقييم نشاط المخدرات. ثم، إعادة لوحة إلى الحاضنة. الآن، ضع اللوحة في غطاء لثقافة الأنسجة، واستبدل بلطف المابير مع 100 ميكرولترات من 1X PBS.الحرص على عدم إزعاج spheroid، وتجنب لمس الكولاجين. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات أخرى. إزالة الغسيل النهائي في كل بئر، واستبدالها مع 100 ميكرولترات من 4٪ الفورمالديهايد في 1X PBS.ضع لوحة 96-well على مقعد مختبر، وتغطية مع احباط، وترك لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، قم بإزالة الفورمالديهايد بعناية، واستبدله بـ 1X PBS. كرر هذا غسل ثلاث مرات أخرى.ثم، استبدال 1X PBS غسل مع 100 ميكرولترات من حل تريتون X-100 أعدت حديثا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، إعداد حل حجب مع 50 ملليلتر من 1X PBS و 05٪ مسحوق الحليب منزوع الدسم في أنبوب 50 ملليلتر، واخلط جيدا.بعد 30 دقيقة، قم بإزالة Triton X-100، واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS 1X. إضافة 100 ميكرولترات من الحل حظر لكل بئر، واحتضان لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تمييع الأجسام المضادة للماوس IgG acetylated الاسيتيلين في العازلة حظر بنسبة واحد إلى 100.الطرد المركزي الأولية لعرقلة الجسم الخليط العازلة لمدة خمس دقائق في 15، 682 مرات ز. إزالة بعناية حل حجب في كل بئر، وإضافة 25 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة حظر العازلة الفائقة من الأنبوب. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم، إزالة حل الأجسام المضادة من كل بئر، وغسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولترات من 1X PBS. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في العازلة منع في التركيز الموصى بها بالإضافة إلى أي بقع الفلورسنت إضافية. مرة أخرى، الطرد المركزي حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة خمس دقائق في 15، 682 مرات ز.إزالة حل حظر من كل بئر، وإضافة 25 إلى 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية سوبرنات. احتضان في الظلام لمدة 1 1/2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المحلل صبغ الأجسام المضادة الثانوية، وغسل ثلاث مرات مع 1X PBS، 100 ميكرولترس في البئر.ارفع بعناية مقابس الكولاجين الفردية عن طريق الشفط مع ماصة بلاستيكية 200 ميكرولتر على وسط شريحة زجاجية. إضافة قطرة واحدة من mountant مناسبة لتغطية الكولاجين المكونات. ضع غطاءً على أعلى العينة، ثم قم بتخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.تكنولوجيا الزفويد ثلاثية الأبعاد هو تعزيز فهم التفاعلات المخدرات ورم لأنها أكثر تمثيلا للبيئة الخاصة بالسرطان. وفي هذه الدراسة، تم الكشف عن آثار محتملة مضادة للهجرة أو مؤيدة لها. هذا ملحوظ بشكل خاص في KNS42 مع يبدو لا ترحيل في عنصر التحكم أو spheroids المعالجة.ولوحظ موت الخلايا في أعلى تركيز مثبطات 10 ميكرومولار. وكان التجزؤ النووي والخلايا المهاجرة واضحين في خلايا U251. وكان U251 الخلايا spheroids المسامير تشع بعيدا عن الزفير الأصلي، مع زيادة التقريب الخلية في الخلايا واضحة مع زيادة تركيز المانع.ولوحظ انهيار المنشآت الصغيرة والتفتت النووي في KNS42. تشير نتوءات ورقة مع طفرات خلية مفردة إلى ترحيل KNS42. في أدنى تركيز مثبطات، كان هذا النمط الظاهري واضحًا ولكنه فُقد مع زيادة تركيز المثبطات.من المهم أن تترك جميع الكواشف على الجليد حتى تصبح جاهزة. خلاف ذلك، يبدأ الكولاجين البلمرة قبل أن يتم إضافة كل ذلك إلى الـ spheroids. هناك مجال لتحديد حجم الصور الناتجة عن المجهر الناسخة لتقييم آثار، على سبيل المثال، المخدرات الميغراتاتتيكية على مورفولوجيا الخلية.وقد سمح لنا، للمرة الأولى، بتأكيد تأثير مثبطات الميجرستاتيكي MI-192 على مستويات أسيتيل ميكروتومومي واستكشاف هذا الأمر بشكل أكبر من حيث هجرة الخلايا. وينبغي توخي المزيد من الحذر عند التعامل مع الفورمالديهايد لخطوة التثبيت. تطبق الإرشادات المعتادة للصحة والسلامة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

على المدى الطويل عالية الدقة حيوي داخلي المجهري في الرئة مع فراغ استقرت النافذة التصوير

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...