Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne takke professor Chris Jones for at have bidraget med KNS42 Cell line. Den Zeiss LSM880 confokale mikroskop med AiryScan anvendes i dette arbejde er en del af Huddersfield innovation og inkubations projektet (HIIP) finansieret gennem Leeds City region Enterprise Partnership (LEP) vækst aftale. Kredit for mikroskop billede figur 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Microscopy@zeiss.com.

1. generering af celle Sfæroider
Dag 1
<ol><li>Forbered standard dyrkningsmediet som krævet af den cellelinje, der undersøges.</li>
	<li>Udfør alle vævskultur-relaterede trin i en vævskultur hætte ved hjælp af sterile håndteringsteknikker.</li>
	<li>Trypsinize og tælle kræftceller. Brug 20 mL cellesuspension pr. plade. Opbevar celle suspensionerne i tydeligt mærkede sterile Universal rør.</li>
	<li>Tilføj et forudbestemt antal celler til hver brønd. Både det ...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

En ny måde at oprette kræft celle sfæroider til identifikation af migræt stof aktivitet ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi er beskrevet. Brugen af lave vedhængende plader over andre teknikker, såsom hængende Drops15, har lettet et middel til at generere reproducerbare og ensartede sfæroider til brug i kollagen migration og invasion assays. De kritiske punkter i denne protokol er fjernelsen af vækstmediet fra 96-brønd pladen forud for celle sfæroide-indlejringen i en kolla...

Tredimensionelle sfæriske teknologier til prækliniske lægemidler opdagelse og udvikling af potentielle kræftlægemidler er i stigende grad favoriseret over konventionelle stof skærme; således er der mere udvikling af migrastatic-migration og invasion forebyggelse-narkotika. Begrundelsen for denne udvikling i kræftbehandling er klar: 3D sfæroide assays repræsenterer en mere realistisk tilgang til screening potentielle anti-cancer stoffer, som de efterligner 3D tumor arkitektur mere trofast end celle enkeltlags kulturer, rekapitulere Drug-tumor interaktioner (kinetik) mere præcist, og tillade karakterisering af narkotika aktivitet i en tumor-relaterede indstilling. Hertil kommer, at stigningen i resistens over for kemo toksiske lægemidler i mange kræfttyper og høje dødelighed blandt kræftpatienter på grund af metastase potenseret af kræftcellernes evne til at migrere til fjerne tumor sites understøtter optagelsen af kemoterapeutika målretning af kræftcellernes migrations potentiale som adjuverende behandling i fremtidige kliniske kræft forsøg1. Dette er især tilfældet i forbindelse med stærkt invasive kræftformer, såsom glioblastomi af høj kvalitet (GBM). GBM Management omfatter kirurgi, strålebehandling, og kemoterapi. Men selv med kombinationsbehandling, de fleste patienter tilbagefald inden for 1 år efter Initial diagnose med en Median overlevelse på 11-15 måneder2,3. Store fremskridt inden for 3D-teknologi er blevet gjort i løbet af de sidste par år: roterende systemer, mikrofabrikerede strukturer og 3D stilladser, og andre individuelle assays løbende forbedres for at muliggøre rutinetest på en stor skala4, 5,6,7. Resultaterne fra disse analyser skal dog analyseres på en meningsfuld måde, fordi data fortolkningen ofte hindres af forsøg på at analysere 3D-genererede data med 2D-billedanalyse systemer.
På trods af at være at foretrække med hensyn til billed erhvervelse hastighed og reduceret foto-toksicitet, de fleste Wide-felt systemer forbliver begrænset af resolution8. Således, bortset fra data læse-outs vedrørende Drug effekt, detaljerede virkninger af narkotika handling på 3D cellulære strukturer af migrerende celler er uundgåeligt tabt, hvis afbildet ved hjælp af et bredt felt system. Omvendt, confokal Laserscanning mikroskopi (CLSM) fanger høj kvalitet, optisk sektionerede billeder, der kan rekonstrueres og gengives i 3D efter erhvervelse ved hjælp af edb-software. Således, CLSM er let anvendelig på billeddannelse komplekse 3D cellulære strukturer, hvilket muliggør afhøring af virkningerne af anti-migrastatiske hæmmere på 3D-strukturer og dybtgående analyser af celle migration mekanismer. Dette vil utvivlsomt guide fremtidige migrastatisk narkotika udvikling. Her beskrives en kombineret arbejdsgang for sfætoid generering, narkotikabehandling, farvnings protokol og karakterisering af højopløsnings Konfokal mikroskopi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Drug opdagelse og udvikling i kræftforskning er i stigende grad baseret på narkotika skærme i et 3D-format. Nye hæmmere, der er rettet mod kræftcellernes migrerende og invasive potentiale, og dermed den metastatiske sygdomsspredning, opdages og betragtes som supplerende behandlinger i stærkt invasive kræftformer såsom gliomer. Således er det nødvendigt at generere data, der muliggør detaljerede analyser af celler i et 3D-miljø efter tilsætning af et lægemiddel. Den beskrevne metode, der kombinerer sfæroide invasion assays med høj opløsning billedoptagelse og dataanalyse af confokal Laserscanning mikroskopi (clsm), aktiveret detaljeret karakterisering af virkningerne af den potentielle anti-migrerende hæmmer MI-192 på gliom-celler. Sfæroider blev genereret fra cellelinjer til invasion assays i lav overholder 96-brønd plader og derefter forberedt til CLSM analyse. Den beskrevne arbejdsgang blev foretrukket frem for andre almindeligt anvendte sfæoidskabende teknikker på grund af både lethed og reproducerbarhed. Dette, kombineret med den forbedrede billedopløsning opnået ved Konfokal mikroskopi sammenlignet med konventionelle bred-felt tilgange, tillod identifikation og analyse af særskilte morfologiske ændringer i migrerende celler i et 3D-miljø efter behandling med det migræstatiske lægemiddel MI-192.

Tredimensionel sfærisk teknologi fremmer forståelsen af lægemiddel tumor interaktioner, fordi det er mere repræsentativt for det kræftspecifikke miljø. Dannelse af sfæroider kan opnås på flere måder; lav vedhæftning 96-brønd plader blev brugt i denne protokol. Efter at have testet flere produkter fra forskellige producenter, blev pladerne, der blev brugt her, valgt, fordi de konsekvent klarede sig bedst i form af en vellykket sfæroide-produktion og ensartethed. Udskiftnings t...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Virkningerne af migrastatiske hæmmere på gliom cancer celle migration i tredimensionelle (3D) invasion assays ved hjælp af en Histon deacetylase (HDAC) hæmmer er karakteriseret ved høj opløsning Konfokal mikroskopi.

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Denne protokol viser, at vi nu kan bestemme effekten af migrastatiske hæmmere i detaljer i 3D-kræftmodeller. Den største fordel er den lethed og alt-i-én tilgang, som denne teknik kan udføres. Denne teknik gør det muligt at vurdere migrænetiske lægemidler i kræftforskning i en 3D-indstilling, så testning af lægemidler i en mere tumor miljø-relevante indstilling.Denne metode kan anvendes til testning af cytotoksiske lægemidler i kræft eller f.eks. Det er nyttigt at praktisere medium fjernelse trin og kollagen udskiftning med almindelige 96-brønd plader til at blive sikker. Også, uddannelse på en konfokal mikroskop er afgørende.Visuel demonstration af denne teknik er afgørende for forskere at forstå den nødvendige delikate håndtering af sfæroider og deres anvendelse i konfokal mikroskopi. På den første forsøgsdag skal du have standardkulturmediet, i dette tilfælde U251, klar til den relevante cellelinje. I en vævskultur hætte, tilføje 0,5 milliliter trypsin i kulturen for at trypsinize kræftcellerne.Tæl kræftcellerne på et hæmocytometer, og fortyndes til en koncentration på fem gange 10 til de tredje celler pr. milliliter. Hold cellesuspensionerne i tydeligt mærkede, sterile universalrør. Resuspend cellerne ved blid inversion for at undgå celleklumpning.Brug en pipette til at tilføje 200 mikroliter af cellekulturen til hver brønd i en 96-brøndplade. Tilføj 200 mikroliter af 1X PBS til hver tom brønd for at undgå fordampning. Inkuber cellerne i en kuvøse ved 37 grader Celsius.Efter 24 timer skal cellerne kontrolleres ved hjælp af mikroskopi med skarpt felt. Cellelinjer såsom gliom kræft cellelinjer form sfæroider i bunden af brønden inden for 24 timer. Inkuber sfæroiderne i yderligere 48 timer for at tillade en 3D-cellulær arkitektur at danne.På den tredje dag, sted kollagen, 5X kultur medium, en-molar natriumhydroxid, og en 20-milliliter rør på is. Tilsæt forsigtigt og langsomt 10,4 milliliter kold kollagen i det kølede kulturrør. Undgå bobler.Derefter forsigtigt tilføje 1,52 milliliter kold steril 5X kultur medium. Undgå bobler. Umiddelbart før brug tilsættes forsigtigt 72 mikroliter kold steril en-molar natriumhydroxid, og hold opløsningen på is.Bland forsigtigt ved pipettering og undgå bobler. Effektiv blanding fører til et farveskift fra rød til orange-rød i mediet. Lad blandingen være på is, indtil den er i brug.Dernæst for at fjerne 190 mikroliter supernatant fra 96-brøndpladen forberedt på dag ét, skal du bruge en pipette i en vinkel mod siden af brønden. Vær meget forsigtig med ikke at forstyrre sfæroider, der dannes i bunden af brønden. Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter af kollagenblandingen til hver brønd, der pipetter ned ad siden af brønden.Undgå bobler og eventuelle sfæroide forstyrrelser. Hold eventuelle resterende kollagen mix i 20-milliliter rør ved stuetemperatur for at vurdere polymerisering. Inkuber pladen i inkubatoren i mindst 10 minutter for at gøre det muligt for kollagen at polymerisere.Når sidesten kollagen bliver semisolid og svamp-lignende, sfæroiderne er klar til at blive behandlet med inhibitor. Tilsæt hæmmere ved 2X koncentration til fem milliliter kulturmedium. Pipette 100 mikroliter af mediet forsigtigt ned på siden af hver brønd for at undgå sfæroide forstyrrelser.Overhold og billede hver sfæroide ved bright-field mikroskopi på tidspunkter af nul time, 24 timer, 48 timer, og 72 timer til at vurdere narkotika aktivitet. Vend derefter pladen tilbage til kuvøsen. Nu skal du placere pladen i en vævskulturhætte, og forsigtigt erstatte supernatanten med 100 mikroliter 1X PBS.Pas på ikke at forstyrre sfæroiden, og undgå at røre kollagen. Gentag dette vasketrin tre gange mere. Fjern den endelige vask i hver brønd, og erstatte med 100 mikroliter af 4% formaldehyd i 1X PBS.Placer 96-brønd plade på en lab bænk, dække med folie, og lad i 24 timer ved stuetemperatur. Den næste dag, forsigtigt fjerne formaldehyd, og erstatte med 1X PBS. Gentag denne vask tre gange mere.Derefter erstattes 1X PBS vask med 100 mikroliter frisklavet Triton X-100 opløsning. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden klargør blokeringsopløsningen med 50 milliliter 1X PBS og 05% skummetmælkspulver i et 50-milliliterrør, og bland grundigt.Efter 30 minutter skal Triton X-100 fjernes, og triton X-100 vaskes tre gange med 1X PBS. Tilsæt 100 mikroliter af blokeringsopløsningen til hver brønd, og inkuber i 15 minutter. Dernæst fortyndes anti-mus IgG acetylerede tubulin antistof i blokerende buffer i et forhold på en til 100.Centrifuge den primære antistofblokerende bufferblanding i fem minutter ved 15,682 gange g. Fjern forsigtigt blokeringsopløsningen i hver brønd, og tilsæt 25 til 50 mikroliter af antistofblokeringsbuffetens supernatant fra røret. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i en time.Fjern derefter antistofopløsningen fra hver brønd, og vask tre gange med 100 mikroliter 1X PBS. Fortyndet sekundært antistof i blokerende buffer ved den anbefalede koncentration ud over eventuelle yderligere fluorescerende pletter. Igen centrifugeres den sekundære antistofopløsning i fem minutter ved 15, 682 gange g.Fjern blokeringsopløsningen fra hver brønd, og tilsæt 25 til 50 mikroliter af det sekundære antistof supernatant. Inkuberes i mørke i 1 1/2 time ved stuetemperatur. Fjern den sekundære antistoffarveopløsning, og vask tre gange med 1X PBS, 100 mikroliter pr. brønd.Løft forsigtigt individuelle kollagenpropper ved at suge med en 200-mikroliterpipette af plast på midten af et glasrutsjebane. Tilføj en dråbe af en egnet mountant til at dække kollagen stikket. Placer en dækslæb oven på prøven, og opbevar diaset ved stuetemperatur i mørke.Tre-dimensionelle sfæriske teknologi fremmer forståelsen af narkotika-tumor interaktioner, fordi det er mere repræsentativt for kræft-specifikke miljø. I denne undersøgelse blev der påvist potentielle anti- eller pro-migrationsvirkninger. Dette er især mærkbar i KNS42 med tilsyneladende ingen migration i enten kontrol eller behandlede sfæroider.Celledød blev observeret ved den højeste hæmmende koncentration af 10 mikromolar. Nuklear fragmentering og migrerende celler var tydelige i U251 celler. U251 celle sfæroider havde pigge udstrålende væk fra den oprindelige sfæroide, med stigende celleafrunding i celler tilsyneladende med stigende hæmmer koncentration.Kollapsede mikrotubuli og nuklear fragmentering blev observeret i KNS42. Arklignende fremspring med enkeltcellespidser angiver KNS42-migrering. Ved den laveste inhibitorkoncentration blev denne fænotype udtalt, men gik tabt med stigende inhibitorkoncentration.Det er afgørende at lade alle reagenser på is, indtil de er klar. Ellers kollagen begynder polymerisering, før det hele er blevet tilføjet til sfæroider. Der er mulighed for at kvantificere de billeder, der genereres af konfokal mikroskopi for at vurdere virkningerne af for eksempel migrænelægemidler på cellemorfologi.Det gav os for første gang mulighed for at bekræfte effekten af den migrastatiske hæmmer MI-192 på mikrotubule acetylationsniveauer og undersøge dette yderligere med hensyn til cellemigration. Der skal være ekstra forsigtighed ved håndtering af formaldehyd til fikseringstrinnet. De sædvanlige retningslinjer for sundhed og sikkerhed gælder.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsigtet High-Resolution Intravital Mikroskopi i Lung med en Vacuum Stabiliseret Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering af tumorceller ved hjælp af en medicinsk Wire for optager cirkulerende tumorceller: en 3D tilgang baseret på immunofluorescens og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode til at definere virkningerne af miljøberigelse på tyktarmen Microbiome biodiversitet i en mus tyktarmen tumoren Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikation, histologiske karakteristika og dissektion af musen prostata lapper til i Vitro 3D klumpformet kultur modeller

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fuldt humant tumor-baserede matrix i tredimensionale Spheroid invasion assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...