Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

We willen professor Chris Jones bedanken voor het bijdragen aan de KNS42 Cell line. De Zeiss LSM880 confocale Microscoop met AiryScan die in dit werk wordt gebruikt, maakt deel uit van het Huddersfield Innovation and incubation project (HIIP) dat wordt gefinancierd door de Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth deal. Krediet voor Microscoop-beeld afbeelding 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Microscopy@zeiss.com.

1. generatie van Celsferioïden
Dag 1
<ol><li>Bereid het standaard kweekmedium voor zoals vereist door de onderzochte cellijn.</li>
	<li>Voer alle met weefselkweek samenhangende stappen uit in een weefselkweek afzuigkap met behulp van steriele behandelingstechnieken.</li>
	<li>Trypsinize en Tel kankercellen. Gebruik 20 mL celsuspensie per plaat. Houd de celsuspensies in duidelijk gelabelde steriele universele buizen.</li>
	<li>Voeg een vooraf bepaald aantal cellen toe aan el...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

Een nieuwe manier om kankercel sferoïden te maken voor de identificatie van de activiteit van migraine met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie wordt beschreven. Het gebruik van lage hecht platen over andere technieken, zoals hangende druppels15, heeft een middel vergemakkelijkt om reproduceerbare en uniforme sferioïden te genereren voor gebruik in de collageen migratie en invasie testen. De kritische punten in dit protocol zijn de verwijdering van het groeimedium van de 96-put voor d...

Driedimensionale spheroid-technologieën voor preklinische geneesmiddelen ontdekking en de ontwikkeling van potentiële kankergeneesmiddelen worden in toenemende mate begunstigd op conventionele drugs schermen; Er is dus meer ontwikkeling van migraine — migratie en invasie voorkomen — drugs. De achterliggende gedachte achter deze ontwikkelingen in de behandeling van kanker is duidelijk: 3D-spheroid-assays vormen een realistischer benadering voor het screenen van potentiële anti-kanker drugs, omdat ze de 3D-tumor architectuur meer getrouw nabootsen dan de monolaag-culturen van cellen, even drug-tumor interacties (kinetiek) nauwkeuriger, en toestaan de karakterisering van drug activiteit in een tumor-gerelateerde setting. Bovendien is de opkomst van resistentie tegen chemotoxische geneesmiddelen in vele soorten kanker en hoge sterftecijfers onder kankerpatiënten als gevolg van metastasen versterkt door het vermogen van kankercellen te migreren naar verre tumor sites ondersteunt de opname van chemotherapeutische agenten gericht op het migratie potentieel van kankercellen als adjuvante behandeling in toekomstige klinische kanker onderzoeken1. Dit is met name het geval bij zeer invasieve kankers, zoals high-grade glioblastomas (GBM). GBM-beheer omvat chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Echter, zelfs met combinatiebehandeling, de meeste patiënten recidief binnen 1 jaar van de initiële diagnose met een mediane overleving van 11-15 maanden2,3. Er zijn de afgelopen jaren enorme vooruitgang geboekt op het gebied van 3D-technologie: rotatieve systemen, micro fabricaat structuren en 3D-steigers, en andere individuele testen worden voortdurend verbeterd om routinematige tests op grote schaal4mogelijk te maken, 5,6,7. De resultaten van deze testen moeten echter op een zinvolle manier worden geanalyseerd, omdat gegevens interpretatie vaak wordt belemmerd door pogingen om 3D-gegenereerde gegevens te analyseren met 2D-beeldanalyse systemen.
Ondanks de voorkeur in termen van beeld acquisitie snelheid en verminderde foto-toxiciteit, blijven de meeste breedveldsystemen beperkt door resolutie8. Zo, afgezien van de gegevens lezen-outs met betrekking tot de werkzaamheid van het geneesmiddel, gedetailleerde effecten van drug actie op 3D cellulaire structuren van migrerende cellen zijn onvermijdelijk verloren als afbeelding gemaakt met behulp van een breed-veld systeem. Omgekeerd, confocale laser scanning microscopie (CLSM) vangt hoge kwaliteit, optisch verdeelde beelden die kunnen worden gereconstrueerd en gerenderd in 3D na overname met behulp van computer software. CLSM is dus gemakkelijk toepasbaar op Imaging complexe 3D cellulaire structuren, waardoor ondervraging van de effecten van anti-migrastatic remmers op 3D structuren en diepgaande analyses van de cel migratie mechanismen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot toekomstige migrastatic drug ontwikkeling. Hier wordt een gecombineerde workflow van spheroid-generatie, medicamenteuze behandeling, kleurings protocol en karakterisering door confocale microscopie met hoge resolutie beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen in kankeronderzoek wordt steeds meer gebaseerd op medicijn schermen in 3D-formaat. Nieuwe remmers gericht op het migratie-en invasief potentieel van kankercellen, en bijgevolg de gemetastaseerde verspreiding van ziekten, worden ontdekt en beschouwd als complementaire behandelingen in zeer invasieve kankers zoals gliomas. Dus, het genereren van gegevens waardoor de gedetailleerde analyses van cellen in een 3D-omgeving na de toevoeging van een medicijn is vereist. De hier beschreven methodologie, het combineren van spheroid invasie testen met hoge resolutie beeldopname en data-analyse door confocale laser scanning microscopie (CLSM), ingeschakeld gedetailleerde karakterisering van de effecten van de potentiële anti-migratie remmer MI-192 op glioom cellen. Spheroids werden gegenereerd uit cellijnen voor invasie testen in laagaanhandig 96-goed platen en vervolgens voorbereid voor CLSM-analyse. De beschreven workflow had de voorkeur boven andere veelgebruikte spheroid-genererende technieken vanwege zowel gemak als reproduceerbaarheid. Dit, in combinatie met de verbeterde beeldresolutie bereikt door confocale microscopie in vergelijking met conventionele breedveld benaderingen, liet de identificatie en analyse toe van verschillende morfologische veranderingen in migratie cellen in een 3D-omgeving na behandeling met de migrastatic drug MI-192.

Driedimensionale spheroid-technologie vordert het begrip van interacties tussen geneesmiddelen en tumoren, omdat het meer representatief is voor de kankerspecifieke omgeving. De generatie van sferoïden kan op verschillende manieren worden bereikt; lage hechting 96-put platen werden gebruikt in dit protocol. Na het testen van verschillende producten van verschillende fabrikanten, werden de hier gebruikte platen gekozen omdat ze consequent het beste presteerden in termen van succesvolle sp...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

De effecten van migraine remmers op glioom kanker Celmigratie in driedimensionale (3D) invasie testen met behulp van een histon deacetylase (HDAC) inhibitor worden gekenmerkt door een hoge resolutie confocale microscopie.

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Dit protocol toont aan dat we nu het effect van migrastatische remmers in detail kunnen bepalen in 3D-kankermodellen. Het belangrijkste voordeel is het gemak en de alles-in-één aanpak waarmee deze techniek kan worden uitgevoerd. Deze techniek maakt het mogelijk de beoordeling van migrastatische geneesmiddelen in kankeronderzoek in een 3D-omgeving, waardoor het testen van geneesmiddelen in een meer tumor-omgeving-relevante omgeving.Deze methode kan worden toegepast op het testen van cytotoxische geneesmiddelen bij kanker of bijvoorbeeld op het beoordelen van het effect van straling op de proliferatie van kanker en celmigratie. Het is nuttig om de medium verwijdering stap en collageen vervanging met gewone 96-well platen te oefenen om vertrouwen te krijgen. Ook is training op een confocale microscoop essentieel.Visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang voor onderzoekers om de vereiste delicate behandeling van de sferoïden en het gebruik ervan in confocale microscopie te begrijpen. Op de eerste dag van experimenteren, hebben de standaard cultuur medium, in dit geval, U251, klaar voor de juiste cellijn. In een weefselkweekkap, voeg 0,5 milliliter trypsine in de cultuur om de kankercellen trypsinize.Tel de kankercellen op een hemocytometer, en verdun tot een concentratie van vijf keer 10 tot de derde cellen per milliliter. Bewaar de celsuspensies in duidelijk gelabelde, steriele universele buizen. Resuspend de cellen door zachte inversie om celklonteren te voorkomen.Gebruik een pipet om 200 microliters van de celcultuur toe te voegen aan elke put in een 96-put plaat. Voeg 200 microliter 1x PBS toe aan elke lege put om verdamping te voorkomen. Broed de cellen in een couveuse op 37 graden Celsius.Controleer de cellen na 24 uur op een helderveldmicroscopie. Cellijnen zoals glioom kanker cellijnen vormen sferoïden in de bodem van de put binnen 24 uur. Incubeer de sferoïden nog 48 uur om een 3D cellulaire architectuur te vormen.Op de derde dag, plaats collageen, 5X cultuur medium, een-kies natriumhydroxide, en een 20-milliliter buis op ijs. Voeg voorzichtig en langzaam 10,4 milliliter koud collageen toe aan de gekoelde kweekbuis. Vermijd bubbels.Voeg vervolgens voorzichtig 1,52 milliliter koud steriel 5X-kweekmedium toe. Vermijd bubbels. Voeg vlak voor gebruik voorzichtig 72 microliters koude steriele natriumhydroxide met één molaire eenkiewijn toe en houd de oplossing op ijs.Meng zachtjes door pipetten en het vermijden van bubbels. Efficiënt mengen leidt tot een kleurverandering van rood naar oranjerood in het medium. Laat het mengsel op ijs tot gebruik.Vervolgens, om 190 microliter van supernatant te verwijderen uit de 96-goed plaat bereid op dag een, gebruik dan een pipet in een hoek naar de zijkant van de put. Wees heel voorzichtig niet te verstoren de sferoïden die gevormd in de bodem van de put. Voeg voorzichtig 100 microliter van de collageenmix toe aan elke put, pipet langs de zijkant van de put.Vermijd bellen en eventuele sferoïde verstoring. Bewaar de resterende collageenmix in de buis van 20 milliliter bij kamertemperatuur om polymerisatie te beoordelen. Incubeer de plaat in de couveuse gedurende ten minste 10 minuten om het collageen te polymeriseren.Wanneer het overgebleven collageen semisolid en sponsachtig wordt, zijn de sferoïden klaar om te worden behandeld met een remmer. Voeg de remmers bij 2X concentratie toe aan vijf milliliter cultuurmedium. Pipette 100 microliter van het medium zachtjes langs de zijkant van elke put om sferoïde verstoring te voorkomen.Observeer en beeld elke sferoïde door helder-veld microscopie op momenten van nul uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur om de activiteit van geneesmiddelen te beoordelen. Breng de plaat vervolgens terug naar de couveuse. Plaats nu de plaat in een weefselkweekkap en vervang de supernatant voorzichtig door 100 microliter van 1X PBS.Zorg ervoor dat u de sferoïde niet verstoort en vermijd het aanraken van het collageen. Herhaal deze wasstap nog drie keer. Verwijder de laatste wasbeurt in elke put en vervang deze door 100 microliter van 4% formaldehyde in 1X PBS.Plaats de 96-put plaat op een lab bank, dek af met folie, en laat gedurende 24 uur op kamertemperatuur. De volgende dag, verwijder voorzichtig de formaldehyde, en vervangen door 1X PBS. Herhaal deze wasbeurt nog drie keer.Vervang vervolgens de 1X PBS-wasbeurt door 100 microliter vers bereide Triton X-100-oplossing. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Bereid ondertussen de blokkeeroplossing voor met 50 milliliter 1X PBS en 05% magere melkpoeder in een buis van 50 milliliter en meng grondig.Verwijder na 30 minuten de Triton X-100 en was drie keer met 1X PBS. Voeg 100 microliter van de blokkeeroplossing toe aan elke put en broed gedurende 15 minuten uit. Vervolgens verdun anti-muis IgG acetylated tubuline antilichaam in de blokkeringsbuffer bij een verhouding van 1 tot 100.Centrifugeren de primaire antilichaam-blokkeren buffer mix gedurende vijf minuten op 15, 682 keer g. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing in elke put en voeg 25 tot 50 microliter van de antilichaamblokkeringsbuffer supernatant uit de buis toe. Broeden in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur.Verwijder vervolgens de antilichaamoplossing uit elke put en was drie keer met 100 microliter 1X PBS. Verdun secundair antilichaam in de blokkeerbuffer bij de aanbevolen concentratie naast eventuele extra fluorescerende vlekken. Nogmaals, centrifugeren de secundaire antilichaam oplossing gedurende vijf minuten op 15, 682 keer g.Verwijder de blokkerende oplossing van elke put en voeg 25 tot 50 microliter van het secundaire antilichaam supernatant toe. Incubeer in het donker gedurende 1 1/2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de secundaire antilichaam kleurstof oplossing, en was drie keer met 1X PBS, 100 microliter per put.Til de afzonderlijke collageenpluggen voorzichtig op door zuigkracht met een plastic pipet van 200 microliter op het midden van een glazen glijbaan. Voeg een druppel van een geschikte mountant om de collageen plug te dekken. Plaats een coverslip bovenop het monster en bewaar de dia op kamertemperatuur in het donker.Driedimensionale sferoïde technologie bevordert het begrip van drug-tumor interacties omdat het meer representatief is voor de kanker-specifieke omgeving. In deze studie werden potentiële anti- of pro-migratieeffecten gedetecteerd. Dit is vooral merkbaar in KNS42 met schijnbaar geen migratie in de controle of behandelde sferoïden.Celdood werd waargenomen bij de hoogste remmerconcentratie van 10 micromolar. Nucleaire fragmentatie en migrerende cellen waren duidelijk zichtbaar in U251 cellen. U251 cel sferoïden had spikes uitstralen weg van de oorspronkelijke sferoïde, met toenemende cel afronding in cellen duidelijk met toenemende remmer concentratie.In KNS42 werden ingestorte microtubuli en nucleaire fragmentatie waargenomen. Bladachtige uitsteeksels met enkele celpieken geven KNS42-migratie aan. Bij de laagste remmerconcentratie werd dit fenotype uitgesproken, maar ging verloren met een toenemende remmerconcentratie.Het is van cruciaal belang om alle reagentia op ijs te laten staan tot ze klaar zijn. Anders begint het collageen te polymeriseren voordat het allemaal is toegevoegd aan de sferoïden. Er is ruimte om de beelden die door confocale microscopie worden gegenereerd te kwantificeren om de effecten van bijvoorbeeld migrastatische geneesmiddelen op celmorfologie te beoordelen.Het stelde ons in staat om voor het eerst het effect van de migrastatische remmer MI-192 op microtubuliacetylatieniveaus te bevestigen en dit verder te onderzoeken in termen van celmigratie. Extra zorg moet worden genomen bij de behandeling van formaldehyde voor de fixatie stap. De gebruikelijke gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen zijn van toepassing.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...