Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
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Nous tenons à remercier le professeur Chris Jones d'avoir contribué à la lignée cellulaire KNS42. Le microscope confocal Zeiss LSM880 avec AiryScan utilisé dans ce travail fait partie du Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP) financé par le Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth Deal. Crédit pour l'image de microscope Figure 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Génération de sphéroïdes cellulaires
Jour 1
<ol><li>Préparer le milieu de culture standard comme l'exige la ligne cellulaire faisant l'objet de l'enquête.</li>
	<li>Effectuer toutes les étapes associées à la culture tissulaire dans une hotte de culture tissulaire en utilisant des techniques de manipulation stériles.</li>
	<li>Trypsiniser et compter les cellules cancéreuses. Utiliser 20 ml de suspension cellulaire par assiette. Gardez les suspensions cellulaires...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

Une nouvelle manière de créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses pour identifier l'activité migrastatique de drogue utilisant la microscopie confocale de haute résolution est décrite. L'utilisation de plaques adhérentes faibles sur d'autres techniques, telles que les gouttes suspendues15, a facilité un moyen de générer des sphéroïdes reproductibles et uniformes pour une utilisation dans la migration du collagène et les essais d'invasion. Les points critiques dans ce protocole so...

Les technologies sphéroïdes tridimensionnelles pour la découverte de médicaments précliniques et le développement de médicaments anticancéreux potentiels sont de plus en plus favorisées par-dessus les écrans de médicaments conventionnels; ainsi, il y a plus de développement des drogues migrastatiques — migration et invasion — . La raison d'être de ces développements dans le traitement du cancer est claire : les essais sphéroïdes 3D représentent une approche plus réaliste pour le dépistage des médicaments anticancéreux potentiels, car ils imitent l'architecture tumorale 3D plus fidèlement que les cultures monocouches cellulaires, récapitulez les interactions médicament-tumeur (cinétique) avec plus de précision, et permettez la caractérisation de l'activité médicamenteuse dans un cadre lié à la tumeur. En outre, l'augmentation de la résistance aux médicaments chimiotoxiques dans de nombreux types de cancer et les taux de mortalité élevés chez les patients atteints de cancer en raison de métastes potentialisées par la capacité des cellules cancéreuses à migrer vers des sites tumoraux éloignés soutient l'inclusion d'agents chimiothérapeutiques ciblant le potentiel migratoire des cellules cancéreuses comme traitement adjuvant dans les futurs essais cliniques sur le cancer1. C'est particulièrement le cas dans les cancers très invasifs, tels que les glioblastomes à haute teneur (GBM). La gestion de GBM inclut la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Cependant, même avec le traitement de combinaison, la plupart des patients rechutent dans un délai de 1 an du diagnostic initial avec une survie médiane de 11-15 mois2,3. D'énormes progrès dans le domaine de la technologie 3D ont été réalisés au cours des dernières années : systèmes rotatifs, structures microfabriquées et échafaudages 3D, et d'autres essais individuels sont continuellement améliorés pour permettre des essais de routine à grande échelle4, 5,6,7. Cependant, les résultats obtenus à partir de ces essais doivent être analysés de manière significative, car l'interprétation des données est souvent entravée par les tentatives d'analyse des données générées en 3D avec des systèmes d'analyse d'images 2D.
Bien qu'ils soient préférables en termes de vitesse d'acquisition d'images et de réduction de la toxicité de la photo, la plupart des systèmes à champ large restent limités par la résolution8. Ainsi, en dehors des données de lecture relatives à l'efficacité des médicaments, les effets détaillés de l'action médicamenteuse sur les structures cellulaires 3D des cellules migrantes sont inévitablement perdus s'ils sont représentés à l'aide d'un système à champ large. Inversement, la microscopie par balayage laser confocal (CLSM) capture des images de haute qualité, sectionnement optique qui peuvent être reconstruites et rendues en 3D après l'acquisition à l'aide d'un logiciel informatique. Ainsi, CLSM est facilement applicable à l'imagerie complexe structures cellulaires 3D, permettant ainsi l'interrogation des effets des inhibiteurs anti-migrastatic sur les structures 3D et des analyses approfondies des mécanismes de migration cellulaire. Cela guidera sans aucun doute le développement futur de médicaments migrastatiques. Ici, un flux de travail combiné de la génération sphéroïde, du traitement de drogue, du protocole de coloration, et de la caractérisation par microscopie confocale à haute résolution est décrit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

La découverte et le développement de médicaments dans la recherche sur le cancer sont de plus en plus basés sur des écrans de médicaments dans un format 3D. De nouveaux inhibiteurs ciblant le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses, et par conséquent la propagation métastatique de la maladie, sont découverts et considérés comme des traitements complémentaires dans les cancers hautement invasifs tels que les gliomes. Ainsi, la génération de données permettant des analyses détaillées des cellules dans un environnement 3D après l'ajout d'un médicament est nécessaire. La méthodologie décrite ici, combinant des essais d'invasion sphéroïde avec la capture d'image à haute résolution et l'analyse des données par microscopie à balayage laser confocal (CLSM), a permis une caractérisation détaillée des effets de l'inhibiteur anti-migratoire potentiel MI-192 sur les cellules de gliome. Des sphéroïdes ont été produits à partir des lignées cellulaires pour des essais d'invasion dans les plaques de 96 puits adhérentes basses et ont ensuite préparé pour l'analyse de CLSM. Le flux de travail décrit a été préféré à d'autres techniques de production sphéroïde couramment utilisées en raison de la facilité et de la reproductibilité. Ceci, combiné à la résolution d'image améliorée obtenue par microscopie confocale par rapport aux approches conventionnelles à large champ, a permis l'identification et l'analyse des changements morphologiques distincts dans les cellules migratrices dans un environnement 3D suivant traitement avec le médicament migrastatique MI-192.

La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicamenteuses parce qu'elle est plus représentative de l'environnement spécifique au cancer. La génération de sphéroïdes peut être réalisée de plusieurs façons; des plaques de 96 puits à faible adhérence ont été utilisées dans ce protocole. Après avoir testé plusieurs produits de différents fabricants, les plaques utilisées ici ont été choisies parce qu'elles ont toujour...

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Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Les effets des inhibiteurs migrastatiques sur la migration de cellules cancéreuses de glioma dans les essais tridimensionnels (3D) d'invasion utilisant un inhibiteur de l'histone deacetylase (HDAC) sont caractérisés par la microscopie confocale à haute résolution.

Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Ce protocole démontre que nous pouvons maintenant déterminer l’effet des inhibiteurs migrastatiques en détail dans les modèles de cancer 3D. Le principal avantage est la facilité et l’approche tout-en-un avec laquelle cette technique peut être effectuée. Cette technique permet l’évaluation des médicaments migrastatiques dans la recherche sur le cancer dans un cadre 3D, permettant l’essai de médicaments dans un environnement plus tumoral pertinent.Cette méthode peut être appliquée au dépistage des médicaments cytotoxiques dans le cancer ou, par exemple, pour évaluer l’effet des radiations sur la prolifération du cancer et la migration cellulaire. Il est utile de pratiquer l’étape d’enlèvement moyen et le remplacement de collagène avec des plaques ordinaires de 96 puits pour devenir confiant. En outre, la formation sur un microscope confocal est essentielle.La démonstration visuelle de cette technique est essentielle pour que les chercheurs comprennent la manipulation délicate requise des sphéroïdes et leur utilisation dans la microscopie confoccale. Le premier jour de l’expérimentation, ont le milieu de culture standard, dans ce cas, U251, prêt pour la ligne cellulaire appropriée. Dans une hotte de culture tissulaire, ajouter 0,5 millilitres de trypsine dans la culture pour trypsiniser les cellules cancéreuses.Comptez les cellules cancéreuses sur un hémocytomètre, et diluer à une concentration de cinq fois 10 à la troisième cellule par millilitre. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels clairement étiquetés et stériles. Resuspendez les cellules par inversion douce pour éviter l’agglutination cellulaire.Utilisez une pipette pour ajouter 200 microlitres de la culture cellulaire à chaque puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter 200 microlitres de 1X PBS à chaque puits vide pour éviter l’évaporation. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius.Après 24 heures, vérifiez les cellules par microscopie à champ lumineux. Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome forment des sphéroïdes au fond du puits dans les 24 heures. Incuber les sphéroïdes pendant encore 48 heures pour permettre à une architecture cellulaire 3D de se former.Le troisième jour, placez du collagène, un milieu de culture 5X, un hydroxyde de sodium molaire et un tube de 20 millilitres sur la glace. Ajouter soigneusement et lentement 10,4 millilitres de collagène froid dans le tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles.Ajouter ensuite délicatement 1,52 millilitres de milieu de culture 5X stérile froid. Évitez les bulles. Juste avant l’utilisation, ajouter délicatement 72 microlitres d’hydroxyde de sodium stérile froid et un molaire, et garder la solution sur la glace.Mélanger délicatement en pipetage et en évitant les bulles. Un mélange efficace conduit à un changement de couleur du rouge au rouge orangé dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu’à utilisation.Ensuite, pour enlever 190 microlitres de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le premier jour, utilisez une pipette à un angle vers le côté du puits. Veillez à ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés au fond du puits. Ajouter délicatement 100 microlitres du mélange de collagène à chaque puits, en descendant le côté du puits.Évitez les bulles et toute perturbation sphéroïde. Conservez tout mélange de collagène restant dans le tube de 20 millilitres à température ambiante pour évaluer la polymérisation. Incuber la plaque dans l’incubateur pendant au moins 10 minutes pour permettre au collagène de polymériser.Lorsque les restes de collagène deviennent semi-solubles et éponge-like, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec inhibiteur. Ajouter les inhibiteurs à la concentration de 2X à cinq millilitres de milieu de culture. Pipette 100 microlitres du milieu doucement sur le côté de chaque puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie à champ lumineux à des moments de zéro heure, 24 heures, 48 heures et 72 heures pour évaluer l’activité médicamenteux. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur. Maintenant, placez la plaque dans une hotte de culture tissulaire, et remplacez doucement le supernatant par 100 microlitres de 1X PBS.Prenez soin de ne pas déranger le sphéroïde, et éviter de toucher le collagène. Répétez cette étape de lavage trois fois de plus. Retirer le lavage final dans chaque puits et remplacer par 100 microlitres de formaldéhyde de 4 % en 1X PBS.Déposer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d’aluminium et laisser pendant 24 heures à température ambiante. Le lendemain, retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1X PBS. Répétez ce lavage trois fois de plus.Ensuite, remplacez le lavage 1X PBS par 100 microlitres de solution Triton X-100 fraîchement préparée. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Entre-temps, préparer la solution de blocage avec 50 millilitres de 1X PBS et 05% de lait écrémé en poudre dans un tube de 50 millilitres, et bien mélanger.Après 30 minutes, retirer le Triton X-100 et laver trois fois avec 1X PBS. Ajouter 100 microlitres de la solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, diluer l’anti-souris IgG anticorps à base de tubuline acétylated dans le tampon de blocage à un rapport de un à 100.Centrifugeuse le mélange tampon primaire anticorps bloquant pendant cinq minutes à 15, 682 fois g. Retirez soigneusement la solution de blocage dans chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant tampon bloquant les anticorps du tube. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure.Ensuite, retirez la solution d’anticorps de chaque puits et lavez-la trois fois avec 100 microlitres de 1X PBS. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée en plus de toute tache fluorescente supplémentaire. Encore une fois, centrifugeuse de la solution d’anticorps secondaire pendant cinq minutes à 15, 682 fois g.Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez de 25 à 50 microlitres du supernatant anticorps secondaire. Incuber dans l’obscurité pendant 1 1/2 heure à température ambiante. Retirez la solution secondaire de colorant anticorps et lavez-la trois fois avec 1X PBS, 100 microlitres par puits.Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique de 200 microlitres sur le centre d’une glissière en verre. Ajouter une goutte d’un montage approprié pour couvrir le bouchon de collagène. Placez un coverslip sur le dessus de l’échantillon et rangez la lame à température ambiante dans l’obscurité.La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicament-tumeur parce qu’elle est plus représentative de l’environnement spécifique au cancer. Dans cette étude, des effets anti-ou pro-migratoires potentiels ont été détectés. Ceci est particulièrement visible dans KNS42 avec apparemment aucune migration dans le contrôle ou les sphéroïdes traités.La mort cellulaire a été observée à la concentration inhibitrice la plus élevée de 10 micromolaires. La fragmentation nucléaire et les cellules migrantes étaient évidentes dans les cellules U251. Les sphéroïdes de cellules U251 ont eu des pointes rayonnant loin du sphéroïde original, avec l’arrondi croissant de cellules dans les cellules apparentes avec la concentration croissante d’inhibiteur.Des microtubules effondrés et la fragmentation nucléaire ont été observés dans KNS42. Les saillies sheetlike avec des pointes de cellule simple indiquent la migration de KNS42. À la concentration d’inhibiteur la plus basse, ce phénotype a été prononcé mais a été perdu avec la concentration croissante d’inhibiteur.Il est crucial de laisser tous les reagents sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts. Sinon, le collagène commence à polymériser avant qu’il n’ait été ajouté aux sphéroïdes. Il est possible de quantifier les images générées par la microscopie confoccale pour évaluer les effets, par exemple, des médicaments migrastatiques sur la morphologie cellulaire.Il nous a permis, pour la première fois, de confirmer l’effet de l’inhibiteur migrastatique MI-192 sur les niveaux d’acétylation microtubule et d’explorer cette question plus en termes de migration cellulaire. Un soin supplémentaire doit être pris lors de la manipulation du formaldéhyde pour l’étape de fixation. Les lignes directrices habituelles en matière de santé et de sécurité s’appliquent.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer des cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur Immunofluorescence et ADN poisson

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Une méthode pour définir les effets de l’enrichissement environnemental sur la biodiversité le Microbiome du côlon dans un modèle murin de tumeur du côlon

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...