Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
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Wir danken Professor Chris Jones für den Beitrag zur KNS42-Zelllinie. Das Konfokalmikroskop Zeiss LSM880 mit AiryScan ist Teil des Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP), das durch den Wachstumsdeal der Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) finanziert wird. Bild bildweise 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Erzeugung von Zellsphäriden
Tag 1
<ol><li>Bereiten Sie das Standardkulturmedium entsprechend der zu untersuchenden Zellenlinie vor.</li>
	<li>Führen Sie alle gewebekulturassoziierten Schritte in einer Gewebekulturhaube mit sterilen Handhabungstechniken durch.</li>
	<li>Versuchen und zählen Sie Krebszellen. Verwenden Sie 20 ml Zellaufhängung pro Platte. Bewahren Sie die Zellsuspensionen in klar beschrifteten sterilen Universalröhren auf.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Bru...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. 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E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. 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Eine neue Möglichkeit, Krebszellsphäride zur Identifizierung der migrastatischen Arzneimittelaktivität mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zu erstellen, wird beschrieben. Die Verwendung von niedrig haftenden Platten gegenüber anderen Techniken, wie hängende Tropfen15, hat ein Mittel zur Erzeugung reproduzierbarer und gleichmäßiger Sphäroide für den Einsatz in der Kollagenmigration und Invasion Assays erleichtert. Die kritischen Punkte in diesem Protokoll sind die Entfernung de...

Dreidimensionale Sphäroid-Technologien für die präklinische Arzneimittelentdeckung und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente werden zunehmend gegenüber herkömmlichen Arzneimittelscreens bevorzugt; daher gibt es mehr Entwicklung von migrastatischen — Migration und Invasionsprävention — Drogen. Die Gründe für diese Entwicklungen in der Krebsbehandlung sind klar: 3D-Sphäroid-Assays stellen einen realistischeren Ansatz für das Screening potenzieller Krebsmedikamente dar, da sie die 3D-Tumorarchitektur getreuer imitieren als Zellmonolayer-Kulturen, Wirkstoff-Tumor-Wechselwirkungen (Kinetik) genauer rekapitulieren und die Charakterisierung der Arzneimittelaktivität in einer tumorbedingten Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt der Anstieg der Resistenz gegen chemotoxische Medikamente bei vielen Krebsarten und die hohe Sterblichkeitsrate bei Krebspatienten aufgrund von Metastasen, die durch die Fähigkeit von Krebszellen potenziert werden, an entfernte Tumorstellen zu wandern, die Einbeziehung von Chemotherapeutika Ausrichtung auf das Migrationspotenzial von Krebszellen als adjuvante Behandlung in zukünftigen klinischen Krebsstudien1. Dies gilt insbesondere für hochinvasive Krebsarten wie hochgradige Glioblastome (GBM). GBM-Management umfasst Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie. Doch selbst bei einer Kombinationsbehandlung fallen die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach der Erstdiagnose mit einem medianen Überleben von 11-15 Monaten2,3zurück. In den letzten Jahren wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der 3D-Technologie erzielt: Rotationssysteme, mikrofabrizierte Strukturen und 3D-Gerüste sowie andere Einzelprüfungen werden kontinuierlich verbessert, um Routinetests im großen Maßstab zu ermöglichen4, 5,6,7. Die ergebnisseweisen aus diesen Assays müssen jedoch sinnvoll analysiert werden, da die Dateninterpretation oft durch Versuche behindert wird, 3D-generierte Daten mit 2D-Bildanalysesystemen zu analysieren.
Obwohl die Bildaufnahmegeschwindigkeit und die reduzierte Fototoxizität bevorzugt sind, bleiben die meisten Breitfeldsysteme durch Auflösung8begrenzt. Abgesehen von Datenauslesungen im Zusammenhang mit der Wirksamkeit von Arzneimitteln gehen detaillierte Auswirkungen der Arzneimittelwirkung auf 3D-Zellstrukturen wandernder Zellen unweigerlich verloren, wenn sie mit einem Weitfeldsystem abgebildet werden. Umgekehrt erfasst die konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) hochwertige, optisch geschnittene Bilder, die in der 3D-Nacherfassung mit Computersoftware rekonstruiert und gerendert werden können. So ist CLSM leicht auf die Abbildung komplexer 3D-Zellstrukturen anwendbar und ermöglicht so die Abfrage der Auswirkungen von anti-migrastatischen Inhibitoren auf 3D-Strukturen und eingehende Analysen von Zellmigrationsmechanismen. Dies wird zweifellos als Richtschnur für die zukünftige Entwicklung migrastatischer Arzneimittel dienen. Hier wird ein kombinierter Workflow aus Sphäroiderzeugung, medikamentöser Behandlung, Färbeprotokoll und Charakterisierung durch hochauflösende konfokale Mikroskopie beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln in der Krebsforschung basiert zunehmend auf Medikamentenscreens im 3D-Format. Neuartige Inhibitoren, die auf das wandernde und invasive Potenzial von Krebszellen und damit auf die metastasierende Ausbreitung von Krankheiten abzielen, werden entdeckt und als ergänzende Behandlungen bei hochinvasiven Krebsarten wie Gliomen betrachtet. Daher ist die Generierung von Daten erforderlich, die die detaillierte Analyse von Zellen in einer 3D-Umgebung nach Zugabe eines Medikaments ermöglichen. Die hier beschriebene Methodik, die Sphäroid-Invasions-Assays mit hochauflösender Bilderfassung und Datenanalyse mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) kombiniert, ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung der Auswirkungen des potenziellen Anti-Migrations-Inhibitors. MI-192 über Gliomzellen. Sphäroide wurden aus Zelllinien für Invasionstests in niedrig haftenden 96-Well-Platten erzeugt und dann für die CLSM-Analyse vorbereitet. Der beschriebene Workflow wurde aufgrund der Einfachheit und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen häufig verwendeten Sphäroid-Erzeugungstechniken bevorzugt. In Kombination mit der verbesserten Bildauflösung, die durch konfokale Mikroskopie im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldansätzen erreicht wurde, ermöglichte dies die Identifizierung und Analyse unterschiedlicher morphologischer Veränderungen in Wanderzellen in einer 3D-Umgebung, Behandlung mit dem migrastatischen Medikament MI-192.

Die dreidimensionale Sphäroidtechnologie fördert das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Tumoren, da sie repräsentativer für die krebsspezifische Umgebung ist. Die Erzeugung von Sphäroiden kann auf verschiedene Weise erreicht werden; in diesem Protokoll wurden 96-Well-Platten verwendet. Nach der Prüfung mehrerer Produkte verschiedener Hersteller wurden die hier verwendeten Platten ausgewählt, da sie hinsichtlich erfolgreicher Sphäroidproduktion und Homogeni...

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Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Die Auswirkungen von migrastatischen Inhibitoren auf die Gliom-Krebszellmigration in dreidimensionalen (3D) Invasions-Assays mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDAC) sind durch eine hochauflösende konfokale Mikroskopie gekennzeichnet.

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Dieses Protokoll zeigt, dass wir nun die Wirkung von migrastatischen Inhibitoren in 3D-Krebsmodellen im Detail bestimmen können. Der Hauptvorteil ist die Leichtigkeit und All-in-One-Ansatz, mit dem diese Technik durchgeführt werden kann. Diese Technik ermöglicht die Beurteilung von migrastatischen Medikamenten in der Krebsforschung in einer 3D-Umgebung, so dass die Prüfung von Medikamenten in einer tumorumgebungsrelevanten Umgebung ermöglicht wird.Diese Methode kann auf Tests von zytotoxischen Medikamenten bei Krebs angewendet werden oder beispielsweise, um die Auswirkungen von Strahlung auf die Krebsproliferation und zellmigration zu bewerten. Es ist nützlich, den mittleren Entfernungsschritt und Kollagenersatz mit gewöhnlichen 96-Well-Platten zu üben, um selbstbewusst zu werden. Auch das Training an einem konfokalen Mikroskop ist unerlässlich.Die visuelle Demonstration dieser Technik ist für die Forscher entscheidend, um den erforderlichen, zarten Umgang mit den Sphäroiden und deren Einsatz in der konfokalen Mikroskopie zu verstehen. Am ersten Tag des Experimentierens, haben Sie das Standardkulturmedium, in diesem Fall U251, bereit für die entsprechende Zelllinie. In einer Gewebekulturhaube, fügen Sie 0,5 Milliliter Trypsin in die Kultur, um die Krebszellen zu trypsinisieren.Zählen Sie die Krebszellen auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Konzentration von fünfmal 10 bis zu den dritten Zellen pro Milliliter. Bewahren Sie die Zellsuspensionen in klar beschrifteten, sterilen Universalröhren auf. Setzen Sie die Zellen durch sanfte Inversion wieder aus, um Zellverklumpungen zu vermeiden.Verwenden Sie eine Pipette, um 200 Mikroliter der Zellkultur zu jedem Brunnen in einer 96-Well-Platte hinzuzufügen. Fügen Sie 200 Mikroliter 1X PBS zu jedem leeren Brunnen hinzu, um Verdunstung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.Überprüfen Sie nach 24 Stunden die Zellen durch Hellfeldmikroskopie. Zelllinien wie Gliom-Krebszelllinien bilden innerhalb von 24 Stunden Sphäroide im Boden des Brunnens. Inkubieren Sie die Sphäroide für weitere 48 Stunden, damit sich eine 3D-Zellarchitektur bilden kann.Legen Sie am dritten Tag Kollagen, 5X Kulturmedium, ein-molares Natriumhydroxid und eine 20-Milliliter-Röhre auf Eis. Sorgfältig und langsam 10,4 Milliliter kaltes Kollagen in die gekühlte Kulturröhre geben. Vermeiden Sie Blasen.Dann fügen Sie vorsichtig 1,52 Milliliter kalte sterile 5X Kulturmedium. Vermeiden Sie Blasen. Kurz vor Gebrauch 72 Mikroliter kaltes steriles Natriumhydroxid mit einem Molaren vorsichtig hinzufügen und die Lösung auf Eis halten.Mischen Sie sanft durch Pipettieren und Vermeidung von Blasen. Effizientes Mischen führt zu einem Farbwechsel von Rot zu Orange-Rot im Medium. Lassen Sie die Mischung auf Eis, bis sie verwendet wird.Als nächstes, um 190 Mikroliter Überstand aus der 96-Well-Platte am ersten Tag vorbereitet zu entfernen, verwenden Sie eine Pipette in einem Winkel zur Seite des Brunnens. Achten Sie sehr darauf, die Sphäroide, die sich im Boden des Brunnens gebildet haben, nicht zu stören. Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter der Kollagenmischung zu jedem Brunnen hinzu und pfeifen Sie die Seite des Brunnens hinunter.Vermeiden Sie Blasen und Sphäroidstörungen. Bewahren Sie die verbleibende Kollagenmischung in der 20-Milliliter-Röhre bei Raumtemperatur auf, um die Polymerisation zu bewerten. Inkubieren Sie die Platte im Inkubator für mindestens 10 Minuten, damit das Kollagen polymerisieren kann.Wenn das übrig gebliebene Kollagen halbfest und schwammartig wird, sind die Sphäroide bereit, mit Inhibitor behandelt zu werden. Fügen Sie die Inhibitoren bei 2X Konzentration auf fünf Milliliter Kulturmedium. Pipette 100 Mikroliter des Mediums sanft an der Seite jedes Brunnens, um Sphäroidstörungen zu vermeiden.Beobachten und abbilden Sie jedes Sphäroid durch Hellfeldmikroskopie zu Zeiten von null Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden, um die Drogenaktivität zu bewerten. Dann kehren Sie die Platte zum Inkubator zurück. Legen Sie nun die Platte in eine Gewebekulturhaube und ersetzen Sie den Überstand vorsichtig durch 100 Mikroliter 1X PBS.Achten Sie darauf, das Sphäroid nicht zu stören, und vermeiden Sie es, das Kollagen zu berühren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch dreimal. Entfernen Sie die Endwäsche in jedem Brunnen, und ersetzen Sie durch 100 Mikroliter 4%Formaldehyd in 1X PBS.Die 96-Well-Platte auf eine Laborbank legen, mit Folie abdecken und 24 Stunden bei Raumtemperatur lassen. Entfernen Sie am nächsten Tag sorgfältig das Formaldehyd und ersetzen Sie es durch 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche noch dreimal.Ersetzen Sie dann die 1X PBS-Waschanlage durch 100 Mikroliter frisch zubereitete Triton X-100 Lösung. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit die Sperrlösung mit 50 Millilitern 1X PBS und 05% Magermilchpulver in einem 50-Milliliter-Rohr vorbereiten und gründlich vermischen.Nach 30 Minuten den Triton X-100 entfernen und dreimal mit 1X PBS waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang. Als nächstes verdünnen Anti-Maus-IgG-Acetylaced-Tubulin-Antikörper im Blockierpuffer im Verhältnis eins zu 100.Zentrifugieren Sie den primären Antikörper-Blockierenden Puffermix für fünf Minuten bei 15, 682 mal g. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierlösung in jedem Brunnen, und fügen Sie 25 bis 50 Mikroliter des Antikörperblockierpuffers aus dem Rohr hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde.Dann entfernen Sie die Antikörperlösung aus jedem Brunnen und waschen Sie dreimal mit 100 Mikroliter 1X PBS. Sekundärantikörper im Sperrpuffer in der empfohlenen Konzentration zusätzlich zu zusätzlichen fluoreszierenden Flecken verdünnen. Zentrifugieren Sie die sekundäre Antikörperlösung für fünf Minuten bei 15, 682 mal g.Entfernen Sie die Blockierlösung aus jedem Brunnen, und fügen Sie 25 bis 50 Mikroliter des sekundären Antikörperüberstandes hinzu. Inder in der Dunkelheit für 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper-Farbstoff-Lösung, und waschen Sie dreimal mit 1X PBS, 100 Mikroliter pro Brunnen.Heben Sie einzelne Kollagenstecker vorsichtig durch Absaugen mit einer 200-Mikroliter-Pipette aus Kunststoff auf die Mitte einer Glasrutsche. Fügen Sie einen Tropfen eines geeigneten Reitmittels hinzu, um den Kollagenstecker zu bedecken. Positionieren Sie einen Coverslip auf der Oberseite der Probe, und lagern Sie die Folie bei Raumtemperatur im Dunkeln.Die dreidimensionale Sphäroidtechnologie fördert das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Tumoren, da sie repräsentativer für die krebsspezifische Umgebung ist. In dieser Studie wurden potenzielle anti- oder pro-migrationsfreundliche Effekte nachgewiesen. Besonders auffällig ist dies bei KNS42 ohne scheinbar keine Migration in den kontrollierbaren oder behandelten Sphäroiden.Der Zelltod wurde bei der höchsten Inhibitorkonzentration von 10 Mikromolaren beobachtet. Nukleare Fragmentierung und wandernde Zellen waren in U251-Zellen offensichtlich. U251-Zellsphäride hatten Spikes, die vom ursprünglichen Sphäroid wegstrahlten, wobei eine zunehmende Zellrundung in Zellen mit zunehmender Inhibitorkonzentration sichtbar wurde.Kollabierte Mikrotubuli und nukleare Fragmentierung wurden in KNS42 beobachtet. Blattartige Vorsprünge mit einzelzelligen Spitzen weisen auf die KNS42-Migration hin. Bei der niedrigsten Inhibitorkonzentration war dieser Phänotyp ausgeprägt, ging aber mit zunehmender Inhibitorkonzentration verloren.Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis zu lassen, bis sie fertig sind. Andernfalls beginnt das Kollagen zu polymerisieren, bevor es den Sphäroiden hinzugefügt wurde. Es gibt Raum, die durch konfokale Mikroskopie erzeugten Bilder zu quantifizieren, um die Auswirkungen beispielsweise von migrastatischen Medikamenten auf die Zellmorphologie zu bewerten.Es ermöglichte uns zum ersten Mal, die Wirkung des migrastatischen Inhibitors MI-192 auf die Mikrotubuli-Acetylierung zu bestätigen und dies im Hinblick auf die Zellmigration weiter zu erforschen. Beim Umgang mit Formaldehyd für den Fixierungsschritt ist besondere Vorsicht geboten. Es gelten die üblichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...