Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

היינו רוצים להודות לפרופסור כריס ג'ונס על שתרמה את קו הטלפון הKNS42. מיקרוסקופ zeiss LSM880 קונפוקלית וקד עם airyscan בשימוש בעבודה זו הוא חלק של חדשנות האדרספילד פרויקט דגירה (hiip) ממומן באמצעות העיר לידס באזור שותפות ארגוני (lep) עסקת צמיחה. קרדיט על תמונת המיקרוסקופ איור 3: מיקרוסקופ קרל Zeiss GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. הדור של הספרואידים תא
היום הראשון
<ol><li>הכן את מדיום התרבות הסטנדרטית כנדרש על-ידי קו התא תחת חקירה.</li>
	<li>בצע את כל תרבות הרקמה הקשורים שלבים במכסה של תרבות הרקמה באמצעות טכניקות טיפול סטרילי.</li>
	<li>טריזיסיזציה וספירת תאים סרטניים. השתמש ב-20 מ ל של השעיית תאים לכל ?...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות15, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות ...

שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים1. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול4, 5,6,7. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.
למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה8. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.

טכנולוגיית ספרואיד תלת ממדית מקדמת את ההבנה של אינטראקציות הגידול בסמים, משום שהיא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. הדור של הספרואידים יכול להיות מושגת במספר דרכים; הדבקות נמוכה 96-לוחיות הרישוי שימשו בפרוטוקול זה. לאחר בדיקת מספר מוצרים מיצרנים שונים, הצלחות המשמשו...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

פרוטוקול זה מדגים כי עכשיו אנחנו יכולים לקבוע את ההשפעה של מעכבי מיגרסטטי בפירוט במודלים סרטן 3D. היתרון העיקרי הוא הגישה הקלה והתמידית שבה ניתן לבצע טכניקה זו. טכניקה זו מאפשרת הערכה של תרופות מיגרסטטיות בחקר הסרטן בסביבה תלת מימדית, ומאפשרת בדיקה של תרופות בסביבה רלוונטית יותר לסביבת הגידול.שיטה זו עשויה להיות מיושמת על בדיקות של תרופות cytotoxic בסרטן או, למשל, כדי להעריך את ההשפעה של קרינה על התפשטות סרטן הגירת תאים. כדאי לתרגל את שלב ההסרה הבינוני והחלפת קולגן עם צלחות רגילות של 96 בארות כדי להיות בטוחים. כמו כן, אימון על מיקרוסקופ קונפוקל הוא חיוני.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית עבור החוקרים להבין את הטיפול העדין הנדרש של כדוריות ושימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית. ביום הראשון של הניסויים, יש את מדיום התרבות הסטנדרטי, במקרה זה, U251, מוכן לקו התא המתאים. במכסה המנוע של תרבות הרקמה, להוסיף 0.5 מיליליטר של טריפסין לתוך התרבות כדי לנסות את התאים הסרטניים.לספור את התאים הסרטניים על hemocytometer, ולדלל לריכוז של חמש פעמים 10 לתאים השלישיים למיליליטר. שמור את מתלי התא בצינורות אוניברסליים סטריליים מסומנים בבירור. תן שימוש חוזר בתאים על ידי היפוך עדין כדי למנוע גוש תאים.השתמש פיפטה להוסיף 200 microliters של תרבות התא לכל באר בצלחת 96 היטב. הוסף 200 מיקרוליטרים של PBS 1X לכל באר ריקה כדי למנוע אידוי. להטמיר את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה שדה בהיר. קווי תאים כגון קווי תאים סרטניים glioma טופס כדוריות בתחתית הבאר בתוך 24 שעות. הדגירה spheroids במשך 48 שעות נוספות כדי לאפשר ארכיטקטורה סלולרית 3D להיווצר.ביום השלישי, מניחים קולגן, מדיום תרבות 5X, נתרן הידרוקסיד אחד טוחן, וצינור אחד 20 מיליליטר על קרח. בזהירות ולאט לאט להוסיף 10.4 מיליליטר של קולגן קר לתוך צינור התרבות המצוננת. הימנע בועות.לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 1.52 מיליליטר של מדיום תרבות סטרילי קר 5X. הימנע בועות. ממש לפני השימוש, מוסיפים בעדינות 72 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד סטרילי קר, שומרים את הפתרון על הקרח.מערבבים בעדינות על ידי צינורות והימנעות בועות. ערבוב יעיל מוביל לשינוי צבע מ אדום לכתום-אדום במדיום. השאירו את התערובת על הקרח עד לשימוש.לאחר מכן, כדי להסיר 190 מיקרוליטרים של על-טבעיים מהצלחת בת 96 הבאר שהוכנה ביום הראשון, השתמשו בפיפסה בזווית לכיוון צד הבאר. היזהר מאוד לא להפריע לספרואידים שנוצרו בתחתית הבירה. מוסיפים בעדינות 100 מיקרוליטרים של תערובת הקולגן לכל באר, צינורות לאורך הצד של באר.הימנע בועות וכל הפרעה כדורית. שמור על כל תערובת קולגן שנותרה בצינור 20 מיליליטר בטמפרטורת החדר כדי להעריך את הפולימריזציה. אין לארוב את הצלחת באינקובטור למשך 10 דקות לפחות כדי לאפשר לקולאגן לעשות פולימריזציה.כאשר שאריות הקולגן הופכות חצי סולידיות וספוגיות, הכדורידים מוכנים לטיפול במעכבים. מוסיפים את המעכבים בריכוז פי 2 לחמישה מיליליטר של מדיום תרבותי. פיפטה 100 מיקרוליטרים של המדיום בעדינות לאורך הצד של כל באר, כדי למנוע הפרעה כדורית.שימו לב ודמיינו כל ספרואיד על ידי מיקרוסקופיה של שדה בהיר בזמנים של אפס שעה, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות להערכת פעילות התרופה. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לאנקובטור. עכשיו, מניחים את הצלחת במכסה המנוע של תרבות הרקמה, ומחליפים בעדינות את העל-טבעי ב-100 מיקרוליטרים של 1X PBS.יש לדאוג לא להפריע לספרואיד, ולהימנע מנגיעה קולגן. חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים נוספות. הסירו את הכביסה הסופית בכל באר, והחליפו ב-100 מיקרוליטרים של 4% פורמלדהיד ב-1X PBS.מניחים את צלחת 96 באר על ספסל מעבדה, לכסות בנייר כסף, ולהשאיר במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. למחרת, להסיר בזהירות את פורמלדהיד, ולהחליף עם 1X PBS. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים נוספות.לאחר מכן, החלף את לשטוף PBS 1X עם 100 microliters של פתרון טריטון X-100 מוכן טרי. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכינו את פתרון החסימה עם 50 מיליליטר של 1X PBS ו-05% אבקת חלב דל שומן בצינור של 50 מיליליטר, ומערבבים היטב.לאחר 30 דקות, להסיר את טריטון X-100, ולשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פתרון החסימה לכל באר, ו דגירה במשך 15 דקות. לאחר מכן, לדלל נוגדן איג-אצטילין איג-עכבר אצטילטין במאגר החסימה ביחס של 1 עד 100.צנטריפוגה תערובת חיץ חסימת הנוגדנים העיקרית במשך חמש דקות ב 15, 682 פעמים גרם. הסר בזהירות את פתרון החסימה בכל באר, והוסף 25 עד 50 מיקרוליטרים של מאגר חסימת הנוגדנים מהצינור. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לאחר מכן, להסיר את פתרון הנוגדנים מכל באר, ולשטוף שלוש פעמים עם 100 microliters של 1X PBS. לדלל נוגדן משני במאגר החסימה בריכוז המומלץ בנוסף לכתמים פלואורסצנטיים נוספים. שוב, צנטריפוגה פתרון הנוגדן המשני במשך חמש דקות ב 15, 682 פעמים גרם.הסר את פתרון החסימה מכל באר, והוסף 25 עד 50 מיקרוליטרים של הנוגדן המשני. דגירה בחושך במשך 1 1/2 שעות בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון צבע הנוגדנים המשני, ושטף שלוש פעמים עם 1X PBS, 100 מיקרוליטרים ל באר.בזהירות להרים תקעים קולגן בודדים על ידי יניקה עם פיפט פלסטיק 200 מיקרוליטר למרכז מגלשת זכוכית. מוסיפים טיפה אחת של הר מתאים כדי לכסות את תקע הקולגן. מקם כיסוי מעל המדגם ואחסן את השקופית בטמפרטורת החדר בחושך.טכנולוגיית ספרואיד תלת מימדי מקדמת את ההבנה של אינטראקציות בין סמים לגידולים כי היא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. במחקר זה, אפקטים פוטנציאליים נגד או פרו נודדים זוהו. זה בולט במיוחד KNS42 עם לכאורה אין הגירה או בשליטה או טיפלו כדורידים.מוות תאי נצפה בריכוז המעכב הגבוה ביותר של 10 מיקרומולרים. פיצול גרעיני ותאים נודדים ניכרו בתאי U251. U251 תאי spheroids היו קוצים מקרין מן הכדורית המקורית, עם הגדלת עיגול התא בתאים ניכר עם ריכוז מעכבי הגדלת.מיקרוטובולים שקרסו ופיצול גרעיני נצפו ב- KNS42. בלטים דמויי גיליון עם קוצים של תא בודד מצביעים על העברת KNS42. בריכוז מעכב הנמוך ביותר, פנוטיפ זה היה מבוטא אבל אבד עם ריכוז מעכבי הגדלת.זה חיוני להשאיר את כל הריג'ים על הקרח עד שהם מוכנים. אחרת, הקולגן מתחיל לפולימר לפני שהכל נוסף לספרואידים. יש היקף לכמת את התמונות שנוצרו על ידי מיקרוסקופיה confocal כדי להעריך את ההשפעות של, למשל, תרופות מיגרסטטיות על מורפולוגיה התא.זה איפשר לנו, בפעם הראשונה, לאשר את ההשפעה של מעכב מיגרסטטי MI-192 על רמות אצטילציה microtubule ולחקור את זה עוד יותר במונחים של הגירת תאים. יש לנקוט בזהירות נוספת בעת טיפול בפורמלדהיד עבור שלב ההתקבעות. הנחיות הבריאות והבטיחות הרגילות חלות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...