Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
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KNS42 세포주에 기여한 크리스 존스 교수님께 감사드립니다. 이 작업에 사용되는 AiryScan을 갖춘 Zeiss LSM880 공초점 현미경은 리즈 시 지역 기업 파트너십 (LEP) 성장 거래를 통해 자금을 조달 한 허더즈필드 혁신 및 인큐베이션 프로젝트 (HIIP)의 일부입니다. 현미경 이미지에대한 신용 그림 3 : 칼 자이스 현미경 GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. 세포 스페로이드의 생성
1일차
<ol><li>조사 중인 세포주에서 요구하는 표준 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>멸균 처리 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 조직 배양 관련 단계를 수행합니다.</li>
	<li>트립시니화 하고 암 세포를 계산합니다. 플레이트당 20 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 셀 현탁액을 명확하게 라벨이 부착된 멸균 범용 튜브에 보관하십?...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

고분해능 공초점 현미경을 사용하여 경화약 활성을 식별하기 위한 암세포 스페로이드를 만드는 새로운 방법이 기술되어 있다. 매달려 방울(15)과같은 다른 기술에 낮은 부착 플레이트의 사용은 콜라겐 이동 및 침략 검정에 사용하기 위해 재현 가능하고 균일 한 스페로이드를 생성하는 수단을 용이하게하고있다. 이 프로토콜의 중요한 점은 콜라겐 매트릭스에 세포 스페로이드가 ...

전임상 신약 발견 및 잠재적인 항암제 개발을 위한 3차원 스페로이드 기술이 기존의 약물 스크린보다 점점 더 선호되고 있다; 따라서, migrastatic의 더 많은 개발이있다 ―이주 및 침략 방지 - 마약. 암 치료에 있는 이 발달의 뒤에 근거는 분명합니다: 3D spheroid 어설아지는 세포 단층 배양 보다는 더 충실하게 3D 종양 건축을 모방하기 때문에 잠재적인 항암약을 검열을 위한 보다 현실적인 접근을 나타냅니다, 약물-종양 상호 작용(역학)을 보다 정확하게 재구성하고 종양 관련 설정에서 약물 활성의 특성화를 허용한다. 또한, 많은 암 유형에서 화학 독성 약물에 대한 내성의 증가와 암 세포가 먼 종양 부위로 이동하는 능력에 의해 전이에 의한 높은 사망률은 화학 요법 제의 포함을 뒷받침합니다. 향후 임상시험에서 보조치료제로 암세포의 철새전위를 표적으로1. 이것은 고도로 침략적인 암에 있는, 고급 교모세포종 (GBM)와 같은 경우에 특히 입니다. GBM 관리에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함됩니다. 그러나, 조합 처리로조차, 대부분의 환자는 11-15 달의중간 생존을 가진 초기 진단의 1 년 안에 재발2,3. 3D 기술 분야의 거대한 발전은 지난 몇 년 동안 이루어졌다 : 회전 시스템, 미세 제작 구조 및 3D 스캐폴드, 및 기타 개별 실험은 지속적으로 대규모4에서일상적인 테스트를 허용하기 위해 개선되고있다4 , 5,6,7. 그러나 이러한 분석에서 얻은 결과는 2D 이미지 분석 시스템으로 3D 생성 데이터를 분석하려는 시도로 인해 데이터 해석이 종종 방해되기 때문에 의미 있는 방식으로 분석되어야 합니다.
이미지 수집 속도와 광 독성 감소 측면에서 바람직함에도 불구하고 대부분의 광시야 시스템은 해상도8에의해 제한됩니다. 따라서, 약물 효능과 관련된 데이터 판독과는 별개로, 광시야 시스템을 사용하여 이미지화하면 이동 세포의 3D 세포 구조에 대한 약물 작용의 상세한 효과는 필연적으로 손실됩니다. 반대로 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3D 후 수집으로 재구성및 렌더링할 수 있는 고품질의 광학 섹션 이미지를 캡처합니다. 따라서 CLSM은 복잡한 3D 세포 구조에 쉽게 적용가능하여 3D 구조에 대한 항미정 억제제의 영향과 세포 이동 메커니즘의 심층 분석을 가능하게 합니다. 이것은 의심 할 여지없이 미래의 신경질성 약물 개발을 안내 할 것입니다. 여기서, 고분해능 공초점 현미경에 의한 스페로이드 생성, 약물 치료, 염색 프로토콜 및 특성화의 결합된 워크플로우가 설명된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

암 연구의 약물 발견 및 개발은 점점 더 3D 형식으로 약물 스크린을 기반으로하고 있습니다. 암세포의 철새 및 침습적 잠재력을 표적으로 하는 새로운 억제제, 그리고 결과적으로 질병의 전이성 퍼짐은, gliomas와 같은 고침성 암에 있는 상보적인 처리로 발견되고 고려되고 있습니다. 따라서, 약물을 첨가한 후 3D 환경에서 세포의 상세한 분석을 가능하게 하는 데이터를 생성하는 것이 요구된다. 여기서 설명한 방법론은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 고해상도 이미지 캡처 및 데이터 분석과 스페로이드 침입 분석법을 결합하여 잠재적인 항철 억제제의 효과에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 했습니다. 신경교종 세포에 MI-192. 스페로이드는 낮은 부착 성 96 웰 플레이트에서 침략 분석세포주에서 생성된 다음 CLSM 분석을 위해 제조하였다. 설명된 워크플로우는 용이성과 재현성 모두로 인해 일반적으로 사용되는 다른 스페로이드 생성 기술보다 선호되었습니다. 이는 기존의 광시야 접근법에 비해 공초점 현미경 검사법에 의해 달성된 향상된 이미지 해상도와 결합하여 3D 환경에서 철새 세포의 뚜렷한 형태학적 변화를 식별하고 분석할 수 있었습니다. mi-192 의 제과약물로 치료할 수 있습니다.

3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 스페로이드의 생성은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다; 낮은 준수 96 웰 플레이트는이 프로토콜에 사용되었다. 다른 제조업체의 여러 제품을 테스트 한 후, 여기에서 사용되는 플레이트는 성공적인 스페로이드 생산 및 균일성 측면에서 일관되게 최고...

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Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

이 프로토콜은 우리가 지금 3D 암 모형에서 상세히 migrastatic 억제제의 효력을 결정할 수 있다는 것을 보여주고 있습니다. 주요 장점은이 기술을 수행 할 수있는 용이성과 올인원 접근 방식입니다. 이 기술은 3D 조정에 있는 암 연구에서 미그레정성 약의 평가를 허용하고, 더 종양 환경 관련 조정에 있는 약의 시험을 허용합니다.이 방법은 암에 있는 세포독성 약의 시험에 적용될 수 있고, 예를 들면, 암 증식 및 세포 이동에 방사선의 효력을 평가하기 위하여. 중간 제거 단계와 콜라겐 교체를 일반 96웰 플레이트로 연습하여 자신감이 되는 것이 유용합니다. 또한, 공초점 현미경에 대한 교육은 필수적입니다.이 기술의 시각적 데모는 연구원이 구체형의 필수 섬세한 취급과 공초점 현미경 검사법에서의 사용을 이해하는 데 중요합니다. 실험 첫날에는 표준 배양 배지가 있으며, 이 경우 U251은 적절한 세포주에 대비한다. 조직 배양 후드에서, 암세포를 트립시니화하기 위해 배양에 트립신의 0.5 밀리리터를 추가합니다.혈종계에 암세포를 계산하고 밀리리터 당 세 번째 세포에 5 배 10의 농도로 희석. 세포 현탁액을 명확하게 표지된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오. 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 세포를 다시 중단합니다.파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 배양의 200 마이크로리터를 추가합니다. 증발을 피하기 위해 빈 웰에 1X PBS200 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.24 시간 후에, 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 세포를 확인하십시오. 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 이내에 우물 의 바닥에 있는 스페로이드를 형성한다. 3D 셀룰러 아키텍처가 형성되도록 48시간 동안 스페로이드를 배양합니다.셋째 날에는 콜라겐, 5X 배양 배지, 수산화 나트륨 1개, 얼음 위에 20밀리리터 튜브 1개를 배치합니다. 차가운 컬러젠 10.4 밀리리터를 차갑게 식힌 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오.그런 다음, 냉멸 균 5X 배양 배지의 1.52 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 거품을 피하십시오. 사용하기 직전에 72마이크로리터의 냉멸 살균 원 어금니 나트륨 수산화나트륨을 부드럽게 추가하고 얼음에 용액을 보관하십시오.피펫팅과 거품을 피하여 부드럽게 섞습니다. 효율적인 혼합은 중간 크기의 빨간색에서 주황색-빨간색으로 색상 변화를 유도합니다. 사용이 될 때까지 혼합물을 얼음위에 둡니다.다음으로, 첫날에 준비된 96웰 플레이트에서 190마이크로리터의 초판을 제거하려면, 파이펫을 웰의 측면을 향해 비스듬히 사용한다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록주의하십시오. 콜라겐 믹스 100마이크로리터를 각 웰에 부드럽게 추가하여 우물의 측면을 피펫으로 바릅니다.거품과 스페로이드 방해를 피하십시오. 20 밀리리터 튜브에 남은 콜라겐 믹스를 실온에서 유지하여 중합을 평가합니다. 콜라겐이 중합할 수 있도록 적어도 10분 동안 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.남은 콜라겐이 반고체및 스폰지같이 되면 스페로이드는 억제제로 치료할 준비가 되어 있습니다. 배양 배지의 5밀리리터에 2X 농도의 억제제를 추가합니다. 스페펫 100 마이크로리터의 배지는 스페로이드 교란을 피하기 위해 각 우물의 측면을 부드럽게 아래로 내려.관찰 및 약물 활동을 평가하기 위해 0 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간의 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 이미지. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 이제 접시를 조직 배양 후드에 놓고 상판을 1X PBS의 100 마이크로리터로 부드럽게 교체하십시오.스페로이드를 방해하지 말고 콜라겐을 만지지 않도록 주의하십시오. 이 워시 단계를 3번 더 반복하십시오. 각 우물의 최종 세척을 제거하고 1X PBS에서 4 %의 포름 알데히드의 100 마이크로 리터로 대체하십시오.96웰 플레이트를 실험실 벤치에 놓고 호일로 덮고 실온에서 24시간 동안 둡니다. 다음 날, 포름알데히드를 조심스럽게 제거하고 1X PBS로 교체하십시오. 이 세척을 세 번 더 반복합니다.그런 다음 1X PBS 워시를 갓 준비한 Triton X-100 용액 100 마이크로리터로 교체하십시오. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 한편, 블로킹 용액은 1X PBS 50 밀리리터와 05%의 탈지 된 분유로 50 밀리리터 튜브에 준비하여 철저히 섞습니다.30분 후 트리톤 X-100을 제거하고 1X PBS로 세 번 세척합니다. 블로킹 솔루션 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 차단 완충제에서 항 마우스 IgG 아세틸화 튜룰린 항체를 희석한다.원심분리기 1차 항체 차단 버퍼 믹스는 15, 682g에서 5분 동안 혼합한다. 각 웰의 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 튜브에서 완충제 슈퍼상극을 차단하는 항체 차단의 25~50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.이어서, 항체 용액을 각 웰에서 제거하고 1X PBS의 100 마이크로리터로 세 번 세척한다. 추가형 얼룩 이외에 권장 농도에서 차단 버퍼에 이차 항체를 희석시. 다시, 원심 분리는 15, 682 g에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리합니다.각 우물에서 차단 용액을 제거하고 이차 항체 상체의 25 ~50 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 1 1/2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체 염료 용액을 제거하고 1X PBS, 100 마이크로리터로 세 번 세척하십시오.개별 콜라겐 플러그를 플라스틱 200 마이크로리터 파이펫으로 흡입하여 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어올립니다. 콜라겐 플러그를 덮기 위해 적합한 마운트젠 1방울을 추가합니다. 샘플 위에 커버슬립을 배치하고 어두운 실온에서 슬라이드를 보관합니다.3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호 작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 이 연구에서는 잠재적인 항철기 또는 프로 철새 효과가 발견되었습니다. 이것은 제어 또는 처리된 스페로이드에 있는 겉보기 마이그레이션이 없는 KNS42에서 특히 두드러지습니다.세포사멸은 10마이크로몰러의 가장 높은 억제제 농도에서 관찰되었다. U251 세포에서 핵 분열과 이동 세포가 분명하게 드러났습니다. U251 세포 스페로이드는 원래 스페로이드에서 멀리 방출 스파이크를했다, 증가 억제제 농도와 명백한 세포반올림 증가와.KNS42에서 붕괴된 소소와 핵 분열이 관찰되었다. 단일 셀 스파이크가 있는 시트 모양의 돌출은 KNS42 마이그레이션을 나타냅니다. 가장 낮은 억제제 농도에서, 이 표현형은 발음되었지만 억제제 농도가 증가함에 따라 손실되었다.준비될 때까지 모든 시약을 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 콜라겐은 모두 스페로이드에 추가되기 전에 중합을 시작합니다. 예를 들어, 세포 형태에 대한 미정 약물의 효과를 평가하기 위해 공초점 현미경 검사법에 의해 생성된 이미지를 정량화하는 범위가 있다.그것은 우리가, 처음으로, 미세 투하 염 분화 수준에 migrastatic 억제제 MI-192의 효력을 확인하고 세포 이동의 관점에서 이것을 더 탐구하는 것을 허용했습니다. 고정 단계를 위해 포름알데히드를 다룰 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다. 일반적인 건강 및 안전 지침이 적용됩니다.

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