Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi vil gjerne takke professor Chris Jones for å bidra med KNS42 cellelinjen. Zeiss LSM880 konfokalmikroskopi mikroskop med AiryScan som brukes i dette arbeidet er en del av Huddersfield Innovation and Inkubasjons Project (HIIP) finansiert gjennom Leeds City region Enterprise Partnership (LEP) vekst avtale. Kreditt for mikroskop bildet Figur 3: Carl Zeiss mikroskopi GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. generering av Cell Spheroids
Dag 1
<ol><li>Klargjør standard kultur medium slik det kreves av cellelinjen under etterforskning.</li>
	<li>Utføre alle vev kultur-tilknyttede trinn i en vev kultur hette ved hjelp av sterile håndtering teknikker.</li>
	<li>Trypsinize og telle kreftceller. Bruk 20 mL celle oppheng per plate. Hold celle suspensjoner i tydelig merket sterile Universalrør.</li>
	<li>Legg til et forhåndsbestemt antall celler i hver brønn. Både det første ...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

En ny måte å skape kreftcelle spheroids for identifisering av migrastatic narkotika aktivitet ved hjelp av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi er beskrevet. Bruken av lave tilhenger plater over andre teknikker, slik som hengende dråper15, har muliggjort et middel til å generere reproduserbar og ensartet spheroids for bruk i kollagen migrasjon og invasjon analyser. Den kritiske punkter i denne protokollen er fjerning av vekstmedium fra 96-brønn plate før celle spheroid innebygging i...

Tredimensjonale spheroid teknologier for prekliniske narkotika oppdagelse og utvikling av potensielle kreft stoffer blir i økende grad favorisert over konvensjonelle narkotika skjermer; Dermed er det mer utvikling av migrastatic-migrasjon og invasjon forebygge-narkotika. Begrunnelsen bak denne utviklingen i kreft behandling er klar: 3D spheroid analyser representerer en mer realistisk tilnærming for screening potensielle anti-kreft narkotika som de etterligner 3D svulst arkitektur mer trofast enn celle monolag kulturer, recapitulate legemiddel-tumor interaksjoner (Kinetics) mer nøyaktig, og tillate karakterisering av narkotika aktivitet i en svulst-relaterte innstillingen. I tillegg, fremveksten av resistens mot chemotoxic narkotika i mange krefttyper og høy dødelighet blant kreftpasienter på grunn av metastasering forsterket av evnen til kreftceller til å migrere til fjerne tumor nettsteder støtter inkludering av kjemoterapeutiske agenter målretting av trekk potensialet av kreftceller som adjuvant behandling i fremtidig klinisk kreft forsøk1. Dette er spesielt tilfelle i svært invasiv kreft, for eksempel høyverdig glioblastomas (GBM). GBM ledelse omfatter kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men selv med Kombinasjonsbehandling, de fleste pasientene tilbakefall innen 1 år etter første diagnose med en median overlevelse av 11-15 måneder2,3. Store fremskritt innen 3D-teknologi har blitt gjort de siste årene: roterende systemer, microfabricated strukturer og 3D-stillaser, og andre individuelle analyser blir kontinuerlig forbedret for å tillate rutinemessig testing på en stor skala4, 5,6,7. Resultatene fra disse analysene må imidlertid analyseres på en meningsfull måte fordi data tolkning ofte hindres av forsøk på å analysere 3D-genererte data med 2D-bildeanalyse systemer.
Til tross for å foretrekke i form av bildet oppkjøpet hastighet og redusert Foto-toksisitet, de fleste Wide-feltet systemer fortsatt begrenset av oppløsning8. Således, bortsett fra data lese-outs knyttet til narkotika effekt, detaljerte effekter av narkotika handling på 3D cellulære strukturer av migrere celler er uunngåelig tapt hvis avbildet ved hjelp av et bredt felt system. Omvendt, konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM) fange høy kvalitet, optisk delt profilen det kan rekonstruert og gjengitt inne 3D stolpe-oppkjøpet benytter computer programvare. Således, CLSM er lett anvendelig å tenkelig innviklet 3D Cellular strukturer, derved muliggjør avhør av effektene av anti-migrastatic hemmere opp på 3D strukturer og inne-dybden analyser av cellen Migration mekanismer. Dette vil utvilsomt veilede fremtidige migrastatic narkotika utvikling. Her beskrives en kombinert arbeidsflyt av spheroid generasjon, legemiddelbehandling, fargeprotokoll og karakterisering av konfokalmikroskopi mikroskopi med høy oppløsning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Drug oppdagelse og utvikling i kreftforskning er i økende grad basert på narkotika skjermer i et 3D-format. Romanen hemmere rettet mot trekk og invasiv potensialet for kreftceller, og følgelig metastatisk spredning av sykdom, blir oppdaget og betraktes som komplementære behandlinger i svært invasiv kreftformer som gliomas. Dermed er det nødvendig å generere data som muliggjør detaljert analyse av celler i et 3D-miljø etter tilsetning av et medikament. Metodikken beskrevet her, kombinerer spheroid invasjon analyser med høyoppløselig bilde fangst og dataanalyse av konfokalmikroskopi laserskanning mikroskopi (CLSM), aktivert detaljert karakterisering av virkningene av den potensielle anti-trekk-hemmer MI-192 på glioma celler. Spheroids ble generert fra cellelinjer for invasjon analyser i lav tilhenger 96-brønn plater og deretter forberedt for CLSM analyse. Den beskrevne arbeidsflyten ble foretrukket fremfor andre brukte spheroid teknikker på grunn av både enkel og reproduserbarhet. Dette, kombinert med forbedret bildeoppløsning oppnådd ved konfokalmikroskopi mikroskopi sammenlignet med konvensjonelle bredt felt tilnærminger, tillot identifisering og analyse av distinkte morfologiske endringer i trekk celler i et 3D-miljø etter behandling med migrastatic stoffet MI-192.

Tredimensjonal spheroid teknologi er fremme forståelsen av narkotika-tumor interaksjoner fordi det er mer representativt for kreft-spesifikke miljø. Generering av spheroids kan oppnås på flere måter; lav tilslutning 96-brønn platene ble brukt i denne protokollen. Etter testing flere produkter fra ulike produsenter, platene som brukes her ble valgt fordi de konsekvent utført best i forhold til vellykket spheroid produksjon og ensartethet. Utskifting trinn, der veksten medium er erst...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Effekten av migrastatic hemmere på glioma kreftcelle migrasjon i tredimensjonale (3D) invasjon analyser ved hjelp av en Histone deacetylase (HDCA) inhibitor er preget av høyoppløselig konfokalmikroskopi mikroskopi.

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Denne protokollen viser at vi nå kan bestemme effekten av migrastatiske hemmere i detalj i 3D-kreftmodeller. Den største fordelen er den enkle og alt-i-ett-tilnærmingen som denne teknikken kan utføres med. Denne teknikken tillater vurdering av migrastatiske legemidler i kreftforskning i en 3D-setting, slik at testing av legemidler i en mer tumormiljø-relevant setting.Denne metoden kan brukes til testing av cytotoksiske legemidler i kreft eller for eksempel for å vurdere effekten av stråling på kreftspredning og cellemigrasjon. Det er nyttig å praktisere middels fjerning trinn og kollagen erstatning med vanlige 96-brønnplater for å bli trygg. Også trening på et konfokalt mikroskop er viktig.Visuell demonstrasjon av denne teknikken er avgjørende for forskere å forstå den nødvendige delikate håndteringen av sfæroidene og deres bruk i konfokal mikroskopi. På den første dagen av eksperimentering, har standard kultur medium, i dette tilfellet, U251, klar for riktig cellelinje. I en vevskulturhette legger du til 0,5 milliliter trypsin i kulturen for å trypsinisere kreftcellene.Tell kreftcellene på et hemocytometer, og fortynne til en konsentrasjon på fem ganger 10 til de tredje cellene per milliliter. Oppbevar cellesuspensjonene i tydelig merkede, sterile universalrør. Resuspend cellene ved mild inversjon for å unngå celle klumper.Bruk en pipette til å legge til 200 mikroliter av cellekulturen til hver brønn i en 96-brønns plate. Tilsett 200 mikroliter 1X PBS til hver tomme brønn for å unngå fordampning. Inkuber cellene i en inkubator ved 37 grader Celsius.Etter 24 timer, sjekk cellene ved lysfeltmikroskopi. Cellelinjer som gliomkreftcellelinjer danner sfæroider i bunnen av brønnen innen 24 timer. Inkuber spheroidene i ytterligere 48 timer for å tillate en 3D-mobilarkitektur å danne.På den tredje dagen, plasser kollagen, 5X kultur medium, en-molar natriumhydroksid, og en 20-milliliter rør på is. Tilsett forsiktig og sakte 10,4 milliliter kaldt kollagen i det kjølte kulturrøret. Unngå bobler.Deretter legger du forsiktig til 1,52 milliliter kaldsterilt 5X kulturmedium. Unngå bobler. Like før bruk, legg forsiktig til 72 mikroliter kaldsteril en-molar natriumhydroksid, og hold løsningen på is.Bland forsiktig ved å pipettere og unngå bobler. Effektiv blanding fører til en fargeendring fra rød til oransje-rød i mediet. La blandingen stå på is til bruk.Deretter, for å fjerne 190 mikroliter supernatant fra 96-brønnsplaten tilberedt på dag én, bruk en pipette i en vinkel mot siden av brønnen. Vær veldig forsiktig så du ikke forstyrrer spheroidene som dannes i bunnen av brønnen. Tilsett forsiktig 100 mikroliter av kollagenblandingen til hver brønn, pipettering ned på siden av brønnen.Unngå bobler og spheroidforstyrrelser. Hold eventuell gjenværende kollagenblanding i 20-milliliterrøret ved romtemperatur for å vurdere polymerisering. Inkuber platen i inkubatoren i minst 10 minutter for å la kollagen polymerisere.Når det gjenværende kollagen blir halvsolid og svamplignende, er spheroidene klare til å behandles med inhibitor. Tilsett hemmerne ved 2X konsentrasjon til fem milliliter kulturmedium. Pipette 100 mikroliter av mediet forsiktig ned på siden av hver brønn for å unngå sfæroid forstyrrelse.Observer og bilde hver sfæroid ved lysfeltmikroskopi til tider på null time, 24 timer, 48 timer og 72 timer for å vurdere narkotikaaktivitet. Deretter returnerer du platen til inkubatoren. Legg nå platen i en vevskulturhette, og erstatt forsiktig supernatanten med 100 mikroliter 1X PBS.Vær forsiktig så du ikke forstyrrer sfæroiden, og unngå å berøre kollagen. Gjenta dette vasketrinnet tre ganger til. Fjern den endelige vasken i hver brønn, og erstatt med 100 mikroliter på 4% formaldehyd i 1X PBS.Plasser 96-brønnsplaten på en laboratoriebenk, dekk med folie, og la stå i 24 timer ved romtemperatur. Neste dag, fjern forsiktig formaldehyd, og erstatt med 1X PBS. Gjenta denne vasken tre ganger til.Deretter erstatter du 1X PBS-vasken med 100 mikroliter nyoppberedte Triton X-100-oppløsning. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. I mellomtiden, forberede blokkeringsløsningen med 50 milliliter 1X PBS og 05% skummet melkepulver i et 50-milliliter rør, og bland godt.Etter 30 minutter, fjern Triton X-100, og vask tre ganger med 1X PBS. Tilsett 100 mikroliter av blokkeringsløsningen til hver brønn, og inkuber i 15 minutter. Deretter fortynner anti-mus IgG acetylated tubulin antistoff i blokkeringsbufferen i forholdet mellom en til 100.Sentrifuger den primære antistoffblokkerende bufferblandingen i fem minutter ved 15, 682 ganger g. Fjern nøye blokkeringsløsningen i hver brønn, og tilsett 25 til 50 mikroliter av antistoffblokkeringsbufferen supernatant fra røret. Inkuber i mørket ved romtemperatur i en time.Fjern deretter antistoffoppløsningen fra hver brønn, og vask tre ganger med 100 mikroliter 1X PBS. Fortynn sekundært antistoff i blokkeringsbufferen ved anbefalt konsentrasjon i tillegg til eventuelle ekstra fluorescerende flekker. Igjen, sentrifugere den sekundære antistoffløsningen i fem minutter ved 15, 682 ganger g.Fjern blokkeringsløsningen fra hver brønn, og legg til 25 til 50 mikroliter av det sekundære antistoffet supernatant. Inkuber i mørket i 1 1/2 timer ved romtemperatur. Fjern den sekundære antistofffargestoffoppløsningen, og vask tre ganger med 1X PBS, 100 mikroliter per brønn.Løft forsiktig individuelle kollagenplugger ved suging med en plastrørsett på 200 mikroliter i plast på midten av et glasssklie. Tilsett en dråpe av et egnet monteringsmiddel for å dekke kollagenpluggen. Plasser en dekkslipp oppå prøven, og oppbevar lysbildet ved romtemperatur i mørket.Tredimensjonal sfæroidteknologi fremmer forståelsen av legemiddel-tumor interaksjoner fordi det er mer representativt for kreftspesifikke miljø. I denne studien ble det påvist potensielle anti- eller pro-migratory effekter. Dette er spesielt merkbart i KNS42 med tilsynelatende ingen migrasjon i enten kontroll eller behandlede sfæroider.Celledød ble observert ved den høyeste hemmerkonsentrasjonen på 10 mikromos. Kjernefysisk fragmentering og migrering av celler var tydelige i U251-celler. U251 celle spheroider hadde pigger som utstråler bort fra den opprinnelige sfæroid, med økende celle avrunding i celler tydelig med økende inhibitor konsentrasjon.Kollapset mikrotubuli og kjernefysisk fragmentering ble observert i KNS42. Arklignende fremspring med enkeltcellepigger indikerer KNS42-migrering. Ved den laveste hemmerkonsentrasjonen ble denne fenotypen uttalt, men gikk tapt med økende hemmerkonsentrasjon.Det er avgjørende å la alle reagensene stå på is til de er klare. Ellers begynner kollagen å polymerisere før alt er lagt til sfæroidene. Det er rom for å kvantifisere bildene generert av konfokal mikroskopi for å vurdere effekten av for eksempel migrastatiske legemidler på cellemorfologi.Det tillot oss, for første gang, å bekrefte effekten av den migrastatiske hemmeren MI-192 på mikrotubuli acetyleringsnivåer og å utforske dette videre når det gjelder cellemigrasjon. Ekstra forsiktighet bør tas ved håndtering av formaldehyd for fikseringstrinnet. De vanlige retningslinjene for helse og sikkerhet gjelder.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Langsiktig høy oppløsning intraMikros i Lung med et vakuum Stabilisert Imaging Window

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode for å definere effekten av miljømessig berikelse på kolon Microbiome biologisk mangfold i en mus kolon svulst modell

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic melanom Spheroid huden modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikasjon og histologiske karakteristikken Disseksjon av musen prostata Lobes for i Vitro 3D Spheroid kultur modeller

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Fullt Human tumor-baserte Matrix i tredimensjonale spheroid Invasion analysen

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...