Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить профессора Криса Джонса за содействие линии клеток KNS42. Конфокальный микроскоп «Зейсс» с AiryScan, используемым в этой работе, является частью проекта по инновациям и инкубации Хаддерсфилда (HIIP), финансируемого за счет партнерства по развитию предпринимательства в Лидсе (LEP). Кредит для микроскопа изображение Рисунок 3: Карл Зейсс Микроскопия GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Поколение сотовых сфероидов
День 1
<ol><li>Подготовьте стандартную среду культуры, как того требует исследуемая линия ячейки.</li>
	<li>Провести все ткани культуры связанных шагов в ткани культуры капот с использованием стерильных методов обработки.</li>
	<li>Трипсиниз...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

Описан новый способ создания сфероидов раковых клеток для выявления мигратической активности препарата с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Использование низких адепт пластин над другими методами, такими как висит капель15, способствовало средства ?...

Трехмерные сфероидные технологии для доклинического открытия лекарственных средств и разработки потенциальных лекарств от рака все чаще отдают предпочтение по сравнению с обычными экранами лекарств; таким образом, наблюдается более развитие мигратического - миграции и предотвращения вторжения - наркотиков. Обоснование этих событий в лечении рака ясно: 3D сфероидных анализов представляют собой более реалистичный подход для скрининга потенциальных противораковых препаратов, поскольку они имитируют 3D архитектуры опухоли более точно, чем монослой культур клеток, более точно подытоживая лекарственное взаимодействие (кинетику) и позволяющий охарактеризовать активность препарата в условиях, связанных с опухолью. Кроме того, рост устойчивости к химиотоксическим препаратам во многих типах рака и высокие показатели смертности среди онкологических больных из-за метастазов, потенцяющихся благодаря способности раковых клеток мигрировать в отдаленные места опухоли, поддерживает включение химиотерапевтических агентов ориентации миграционный потенциал раковых клеток в качестве адъювантного лечения в будущих клинических испытаний рака1. Это особенно верно при высокоинвазивных раковых заболеваниях, таких как высококачественные глиобластомы (ГБМ). GBM управление включает в себя хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Однако, даже при комбинированном лечении, большинство пациентов рецидива в течение 1 года с начала диагностики со средней выживаемости 11-15 месяцев2,3. Огромные достижения в области 3D-технологий были сделаны за последние несколько лет: вращающиеся системы, микрофабрикаты структур и 3D эшафот, и другие индивидуальные анализы постоянно совершенствуются, чтобы позволить рутинное тестирование в больших масштабах4, 5,6,7. Однако результаты, полученные в результате этих анализов, должны быть проанализированы значимым образом, поскольку интерпретация данных часто затрудняется попытками анализа 3D-данных с помощью 2D-систем анализа изображений.
Несмотря на предпочтительность с точки зрения скорости приобретения изображения и снижения фототоксичности, большинство широкоугольных систем остаются ограниченными резолюцией8. Таким образом, помимо данных считывание из-за эффективности препарата, подробное воздействие действия препарата на 3D клеточные структуры мигрирующих клеток неизбежно теряется, если наснимки с помощью широкоугольной системы. И наоборот, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) захватывает высококачественные оптически секционные изображения, которые могут быть реконструированы и представлены в 3D пост-приобретении с помощью компьютерного программного обеспечения. Таким образом, CLSM легко применим к сложным 3D-клеточным структурам, что позволяет проводить анализ воздействия антимиграстатических ингибиторов на 3D-структуры и проводить углубленный анализ механизмов миграции клеток. Это, несомненно, будет определять будущую разработку миграстатических препаратов. Здесь описан комбинированный рабочий процесс генерации сфероидов, медикаментозного лечения, протокола окрашивания и характеристики с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Обнаружение и разработка лекарственных средств в исследованиях рака все чаще основывается на экранах лекарств в 3D-формате. Новые ингибиторы, нацеленные на мигрирующие и инвазивные потенциал раковых клеток, и, следовательно, метастатическое распространение болезни, в настоящее время обнаружены и рассматриваются в качестве дополнительного лечения в высокоинвазивных раковых заболеваний, таких как глиомы. Таким образом, требуется создание данных, позволяющих провести детальный анализ клеток в 3D-среде после добавления препарата. Описанная здесь методология, сочетающая анализ ысфероидов с высоким разрешением захвата изображений и анализа данных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), позволила детально охарактеризовать последствия потенциального антимиграционного ингибитора МИ-192 на клетках глиомы. Сфероиды были созданы из клеточных линий для анализа вторжения в низких адептов 96-колодцев, а затем подготовлены для анализа CLSM. Описанный рабочий процесс был предпочтительнее по сравнению с другими широко используемыми методами генерации сферидов из-за легкости и воспроизводимости. Это, в сочетании с улучшенным разрешением изображения, достигнутым с помощью конфокальной микроскопии по сравнению с обычными широкоугольными подходами, позволило выявить и проанализировать различные морфологические изменения в мигрирующих клетках в 3D-среде после лечение миграстатическим препаратом Ми-192.

Трехмерная сфероидная технология продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативной для специфической для рака среды. Поколение сфероидов может быть достигнуто несколькими способами; в этом протоколе использовались ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Влияние миграстатических ингибиторов на миграцию клеток рака глиомы в трехмерных (3D) инватифицированных анализах с использованием ингибитора гистона деацетилазы (HDAC) характеризуется конфокальной микроскопией высокого разрешения.

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Этот протокол демонстрирует, что теперь мы можем определить эффект миграстатических ингибиторов подробно в 3D-моделях рака. Основным преимуществом является простота и все-в-одном подход, с помощью которого эта техника может быть выполнена. Этот метод позволяет оценить миграстатические препараты в исследованиях рака в 3D-настройках, что позволяет тестировать препараты в более опухолевой среде, соответствующей условиям.Этот метод может быть применен к тестированию цитотоксических препаратов при раке или, например, для оценки влияния радиации на распространение рака и миграцию клеток. Полезно практиковать средний шаг удаления и замену коллагена с обычными пластинами 96-хорошо, чтобы стать уверенным. Кроме того, обучение на конфокальный микроскоп имеет важное значение.Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для исследователей, чтобы понять необходимую деликатную обработку сфероидов и их использование в конфокальные микроскопии. В первый день экспериментов, имеют стандартную культуру среды, в данном случае, U251, готовы к соответствующей линии ячейки. В капюшоне культуры ткани, добавить 0,5 миллилитров трипсина в культуру, чтобы трипсинизировать раковые клетки.Подсчитайте раковые клетки на гемоцитометре и разбавляйте до концентрации в пять раз от 10 до третьих клеток на миллилитр. Держите подвески клеток в четко обозначенных, стерильных универсальных трубках. Resuspend клетки нежной инверсии, чтобы избежать клетки слипания.Используйте пипетку, чтобы добавить 200 микролитров клеточной культуры к каждому колодец в 96-хорошо пластины. Добавьте 200 микролитров 1X PBS к каждому пустой колодец, чтобы избежать испарения. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию.Через 24 часа проверьте клетки с помощью ярко-полевой микроскопии. Клеточные линии, такие как линии раковых клеток глиомы образуют сфероиды в нижней части колодеца в течение 24 часов. Инкубировать сфероиды в течение еще 48 часов, чтобы 3D клеточной архитектуры в форме.На третий день поместите коллаген, 5X культурную среду, гидроксид натрия с одним моляром и одну 20-миллилитровую трубку на льду. Аккуратно и медленно добавьте 10,4 миллилитров холодного коллагена в охлажденную культурную трубку. Избегайте пузырей.Затем аккуратно добавьте 1,52 миллилитров холодной стерильной среды культуры 5X. Избегайте пузырей. Перед использованием аккуратно добавьте 72 микролитров холодного стерильного гидроксида натрия и держите раствор на льду.Смешайте осторожно, трубчатые и избегая пузырьков. Эффективное смешивание приводит к изменению цвета от красного до оранжево-красного в среде. Оставьте смесь на льду до использования.Далее, чтобы удалить 190 микролитров супернатанта из 96-хорошо пластины подготовлены в первый день, используйте пипетку под углом к стороне от хорошо. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить сфероиды, которые образуются в нижней части хорошо. Аккуратно добавьте 100 микролитров коллагеновой смеси к каждой хорошо, трубя вниз по стороне колодец.Избегайте пузырьков и любых нарушений сфероидов. Храните любую оставшуюся коллагеновую смесь в 20-миллилитровой трубке при комнатной температуре для оценки полимеризации. Инкубировать пластину в инкубаторе, по крайней мере 10 минут, чтобы коллаген полимеризуется.Когда оставшийся коллаген становится полутвердым и губчатым, сфероиды готовы к лечению ингибитором. Добавьте ингибиторы при концентрации 2X в пять миллилитров среды культуры. Pipette 100 микролитров среды мягко вниз стороне каждого хорошо, чтобы избежать нарушения сфероидов.Наблюдайте и изображения каждого сфероида с помощью ярко-полевой микроскопии во время нулевого часа, 24 часов, 48 часов и 72 часов для оценки активности наркотиков. Затем верните тарелку в инкубатор. Теперь поместите пластину в капюшон культуры тканей и аккуратно замените супернатант 100 микролитров 1X PBS.Позаботьтесь, чтобы не беспокоить сфероид, и избежать прикосновения к коллагену. Повторите этот шаг мытья еще три раза. Удалите окончательную стирку в каждой хорошо, и заменить 100 микролитров 4%формальдегида в 1X PBS.Поместите 96-хорошо пластины на скамейке лаборатории, накрыть фольгой, и оставить на 24 часа при комнатной температуре. На следующий день осторожно удалите формальдегид и замените 1X PBS. Повторите эту стирку еще три раза.Затем замените мытье 1X PBS 100 микролитров свежеприготовленного раствора Triton X-100. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. В то же время, подготовить блокирующий раствор с 50 миллилитров 1X PBS и 05% обезжиренного сухого молока в 50-миллилитровой трубке, и тщательно перемешать.Через 30 минут, удалить Triton X-100, и мыть три раза с 1X PBS. Добавьте 100 микролитров блокирующего раствора в каждую колодец и инкубировать в течение 15 минут. Далее разбавляют антимышки IgG ацетилированным тубулином антителом в блокирующего буфера в соотношении от одного до 100.Центрифуга основной блокирующей антитела буферной смеси в течение пяти минут в 15, 682 раза г. Аккуратно удалите блокирующий раствор в каждой хорошо, и добавьте от 25 до 50 микролитров антитела, блокирующего буферный супернатант из трубки. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение одного часа.Затем удалите раствор антитела из каждой хорошо, и мыть три раза с 100 микролитров 1X PBS. Разбавить вторичное антитело в блокирующего буфера при рекомендуемой концентрации в дополнение к любым дополнительным флуоресцентным пятнам. Опять же, центрифуга вторичного раствора антител в течение пяти минут в 15, 682 раз г.Удалите блокирующий раствор из каждой хорошо, и добавить от 25 до 50 микролитров вторичного антитела supernatant. Инкубировать в темноте в течение 1 1 / 2 часа при комнатной температуре. Удалите вторичный раствор красителя антитела, и мыть три раза с 1X PBS, 100 микролитров на колодец.Тщательно поднимите отдельные коллагеновые пробки путем всасывания с пластиковой 200-микролитровой пипеткой на центр стеклянной горки. Добавьте одну каплю подходящего крепления, чтобы покрыть коллагеновую вилку. Распоимить крышку поверх образца и хранить слайд при комнатной температуре в темноте.Трехмерная технология сфероидов продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативна для среды, специфичной для рака. В этом исследовании были выявлены потенциальные анти- или промигрущие эффекты. Это особенно заметно в KNS42 с, казалось бы, без миграции ни в контроле или обработанных сфероидов.Гибель клеток наблюдалась при самой высокой концентрации ингибитора в 10 микромоляров. Ядерная фрагментация и мигрирующие клетки были очевидны в клетках U251. U251 клеточных сфероидов были шипы, излучающие от оригинального сфероида, с увеличением клеток округливания в клетках очевидно с увеличением концентрации ингибитора.В KNS42 наблюдались обрушения микротрубочек и фрагментация ядерного оружия. Листовые выступы с одноклеточными шипами указывают на миграцию KNS42. При самой низкой концентрации ингибитора, этот фенотип был выражен, но был потерян с увеличением концентрации ингибитора.Очень важно оставить все реагенты на льду до готовности. В противном случае, коллаген начинает полимеризации, прежде чем все это было добавлено в сфероиды. Существует возможность количественной оценки изображений, генерируемых конфокальные микроскопии для оценки влияния, например, миграстатических препаратов на морфологию клеток.Это позволило нам впервые подтвердить влияние миграстатического ингибитора МИ-192 на уровни ацетилирования микротрубочек и изучить это дальше с точки зрения миграции клеток. При обработке формальдегида следует позаботиться о дополнительном уходе за шагом фиксации. Применяются обычные правила охраны труда и техники безопасности.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Долгосрочный высокого разрешения Прижизненные микроскопии в легких с помощью вакуумного стабилизированный визуализации окна

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Характеристика опухолевых клеток с помощью медицинская проволока для захвата циркулирующих клеток опухоли: 3D подход, основанный на иммунофлюоресценции и ДНК рыбы

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Метод для определения последствий экологических обогащения на биоразнообразие Микрофлора толстой кишки в мышиной модели опухоли толстой кишки

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Идентификация, Гистологическая характеристика и рассечение мыши простаты лопастями для в Vitro 3D сфероида культура модели

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...