Name: characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Profesör Chris Jones'a KNS42 hücre hattına katkıda bulunanlara teşekkür ederiz. Bu çalışmada kullanılan AiryScan ile Zeiss LSM880 konfokal mikroskobu Huddersfield Yenilik ve Kuluçka Projesi (HIIP) Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Büyüme Anlaşması ile finanse bir parçasıdır. Mikroskop görüntüsü için Kredi Şekil 3: Carl Zeiss Mikscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Hücre Spheroids Üretimi
1. Gün
<ol><li>Araştırma altındaki hücre hattının gerektirdiği standart kültür ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Steril işleme tekniklerini kullanarak doku kültürü ile ilişkili tüm adımları bir doku kültürü başlık yürütmek.</li>
	<li>Kanser hücrelerini deneyin ve sayın. Plaka başına 20 mL hücre süspansiyonu kullanın. Hücre süspansiyonlarını açıkça etiketli steril evrensel tüplerde tutun.</li>
	<li>Her kuyu...

<ol>
	<li>Gandalovi&#269;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs:+promises+and+challenges.">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li><li>Delgado-L&#243;pez, P. D., Corrales-Garc&#237;a, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+in+glioblastoma:+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities.">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).</li><li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma.">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).</li><li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling.">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li><li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures.">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), (2015).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening.">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).</li><li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microwell-mesh:+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform.">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253 (2018).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques.">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Pont&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+human+glia+cells+in+culture.">Neoplastic human glia cells in culture.</a> Human Tumor Cells in Vitro. , 175-206 (1975).</li><li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line,+KNS-42.">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li><li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Bo&#235;da, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li><li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation.">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li><li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors,+a+promising+approach.">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li><li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192.">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li><li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li><li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays.">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29 (2012).</li><li>H&#228;rm&#228;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis.">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).</li></ol>

Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanarak migrastatik ilaç aktivitesinin belirlenmesi için kanser hücresi küresel oluşturmak için yeni bir yol açıklanmıştır. Diğer teknikler üzerinde düşük yapışkan plakaların kullanımı, bu tür damla asılı15, kollajen göç ve istila tahlilleri kullanılmak üzere tekrarlanabilir ve tek tip sferoidler üreten bir araç kolaylaştırmıştır. Bu protokoldeki kritik noktalar, kollajen matrisine hücre küresel katıştırma i?...

Preklinik ilaç keşfi ve potansiyel kanser ilaçlarının geliştirilmesi için üç boyutlu küresel teknolojiler giderek geleneksel ilaç ekranları üzerinde tercih edilmektedir; böylece, migrastatik daha fazla gelişme var - göç ve işgali önleme - uyuşturucu. Kanser tedavisindeki bu gelişmelerin ardındaki mantık açıktır: 3D küresel tahliller, 3D tümör mimarisini hücre monokatmanlı kültürlere göre daha sadık bir şekilde taklit ettikleri için potansiyel anti-kanser ilaçlarının taranması için daha gerçekçi bir yaklaşım dır. ilaç-tümör etkileşimlerini (kinetik) daha doğru bir şekilde özetler ve tümörle ilgili bir ortamda ilaç aktivitesinin karakterizasyonuna izin verir. Buna ek olarak, birçok kanser türünde kemotoksik ilaçlara karşı direncin artması ve kanser hücrelerinin uzak tümör bölgelerine göç etme yeteneği ile güçlü metastaz nedeniyle kanser hastaları arasında yüksek ölüm oranları kemoterapötik ajanların dahil edilmesini destekler gelecekteki klinik kanser çalışmalarında adjuvan tedavi olarak kanser hücrelerinin göç potansiyelini hedefleme1. Bu durum özellikle yüksek dereceli glioblastomlar (GBM) gibi yüksek invaziv kanserlerde geçerlidir. GBM yönetimi cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi içerir. Ancak, kombinasyon tedavisi ile bile, çoğu hasta 11-15 ay ortanca sağkalım ile ilk tanı 1 yıl içinde nüks2,3. 3D teknolojisi alanında büyük gelişmeler son birkaç yıl içinde yapılmıştır: rotatif sistemler, mikrofabrikasif yapılar ve 3D iskeleler, ve diğer bireysel tahliller sürekli büyük ölçekli rutin test sağlamak için geliştirilmektedir4, 5,6,7. Ancak, veri yorumlama genellikle 2B görüntü analiz sistemleri ile 3D oluşturulan verileri analiz girişimleri tarafından engellenir, çünkü bu tahlillerden elde edilen sonuçlar anlamlı bir şekilde analiz edilmelidir.
Görüntü edinme hızı ve azaltılmış foto-toksisite açısından tercih edilmesine rağmen, en geniş alan sistemleri çözünürlük8ile sınırlı kalır. Bu nedenle, uyuşturucu etkinliğiyle ilgili veri okumalarının yanı sıra, geniş alan sistemi kullanılarak görüntülendiği takdirde, uyuşturucu eyleminin göç eden hücrelerin 3B hücresel yapıları üzerindeki ayrıntılı etkileri kaçınılmaz olarak kaybolmaktadır. Buna karşılık, confocal lazer tarama mikroskobu (CLSM) bilgisayar yazılımı kullanılarak 3D satın alma sonrası yeniden inşa edilebilir ve işlenebilir yüksek kaliteli, optik kesitli görüntüler yakalar. Böylece CLSM, kompleks 3D hücresel yapıların görüntülenmesi için kolayca uygulanabilir ve böylece anti-migrastatik inhibitörlerin 3Boyutlu yapılar üzerindeki etkilerinin sorgulanmasını ve hücre geçiş mekanizmalarının derinlemesine analizlerinin incelenmesini sağlar. Bu şüphesiz gelecekteki migrastatik ilaç gelişimine rehberlik edecektir. Burada, küresel nesil kombine bir iş akışı, ilaç tedavisi, boyama protokolü, ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizasyon açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail, 100 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5648</td>
			<td>needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;&#160; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965062</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>various</td>
			<td>various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for microscopic imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 M)</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastettes (graduated pipette, 3ml)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for invasion assay, solution removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, sterile for tissue culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML&#160;&#160;</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep (antibiotics)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>needed for cell culture of glioma cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td>for trypsinisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low attachment plates</td>
			<td>Sigma/Nunc</td>
			<td>CLS7007-24EA</td>
			<td>for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)</td>
			<td>various e.g. Costar</td>
			<td>CLS4488-50; CLS4487-50</td>
			<td>for tissue culture and collagen preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>various multichannel (50 - 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>for cell and spheroid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscopy</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td>various</td>
			<td>for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>quote from manufacturer</td>
			<td>Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3d tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy

Kanser araştırmalarında ilaç keşfi ve gelişimi giderek 3D formatında ilaç ekranları üzerinde kuruluyor. Kanser hücrelerinin göçmen ve invaziv potansiyelini ve dolayısıyla hastalığın metastatik yayılımını hedefleyen yeni inhibitörler, gliomas gibi yüksek invaziv kanserlerde keşfedilmekte ve tamamlayıcı tedaviler olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, bir ilacın eklenmesinden sonra 3Boyutlu bir ortamda hücrelerin ayrıntılı analizlerini sağlayan veri üretmek gereklidir. Burada açıklanan metodoloji, yüksek çözünürlüklü görüntü yakalama ve konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) ile veri analizi ile küresel invazyon tahlilleri birleştirerek, potansiyel anti-göçmen inhibitörü etkilerinin ayrıntılı karakterizasyonu sağladı Mi-192 glioma hücrelerinde. Sferoidler düşük yapışık 96-iyi plakalar invazyon tahlilleri için hücre hatlarından üretildi ve daha sonra CLSM analizi için hazırlandı. Açıklanan iş akışı, hem kolaylık hem de tekrarlanabilirlik nedeniyle yaygın olarak kullanılan küresel üretim tekniklerine göre tercih edilebildi. Konfokal mikroskopi ile elde edilen gelişmiş görüntü çözünürlüğü ile birlikte konvansiyonel geniş alan yaklaşımları, göçmen hücrelerdeki farklı morfolojik değişikliklerin tanımlanmasına ve analiz inanılmaktadır. migrastatik ilaç MI-192 ile tedavi.

Üç boyutlu küresel teknoloji kansere özgü ortamın daha fazla temsilcisi olduğu için ilaç-tümör etkileşimleri anlayışı nı ilerletmektedir. Küresel lerin üretimi çeşitli şekillerde elde edilebilir; bu protokolde düşük yapışma 96-kuyu plakaları kullanılmıştır. Farklı üreticilerin çeşitli ürünleri test ettikten sonra, burada kullanılan plakalar sürekli başarılı küresel üretim ve tekdüzelik açısından en iyi performans çünkü seçildi. Büyüme ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy at JoVE.com

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Histon deasetilez (HDAC) inhibitörü kullanılarak yapılan üç boyutlu (3D) invazyon tahlillerinde migrastatik inhibitörlerin glioma kanser hücresi göçü üzerindeki etkileri yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile karakterizedir.

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Bu protokol, migrastatik inhibitörlerin etkisini 3Boyutlu kanser modellerinde ayrıntılı olarak belirleyebileceğimizi gösteriyor. En büyük avantajı, bu tekniğin uygulanabileceği kolaylık ve hepsi bir e-bir yaklaşımdır. Bu teknik, kanser araştırmalarında migrastatik ilaçların 3Boyutlu bir ortamda değerlendirilmesine olanak sağlayarak, ilaçların daha tümör ortamıyla ilgili bir ortamda test edilmesine olanak sağlar.Bu yöntem kanserde sitotoksik ilaçların test edilmesi veya örneğin radyasyonun kanser proliferasyonu ve hücre göçü üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanabilir. Bu emin olmak için sıradan 96-iyi plakalar ile orta kaldırma adım ve kollajen replasmanı uygulama yararlıdır. Ayrıca, konfokal mikroskop eğitimi esastır.Bu tekniğin görsel gösterimi araştırmacılar ın küresel oidlerin gerekli hassas kullanımını ve konfokal mikroskopide kullanımını anlamaları açısından çok önemlidir. Denemenin ilk gününde, standart kültür ortamına sahip olun, bu durumda, U251, uygun hücre hattı için hazır. Bir doku kültürü başlık olarak, kanser hücrelerini denemek için kültüriçine tripsin 0.5 mililitre ekleyin.Bir hemositometre üzerinde kanser hücrelerini saymak ve mililitre başına üçüncü hücrelere beş kez 10 bir konsantrasyon seyreltmek. Hücre süspansiyonlarını açıkça etiketlenmiş, steril evrensel tüplerde tutun. Hücre kümelenmesini önlemek için hücreleri nazik bir şekilde tersine çevirme ile yeniden askıya alın.96 kuyulu bir plaka içinde her kuyuya hücre kültürünün 200 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın. Buharlaşmayı önlemek için her boş kuyuya 200 mikrolitre 1X PBS ekleyin. Hücreleri 37 derecede bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.24 saat sonra, parlak alan mikroskobu ile hücreleri kontrol edin. Glioma kanser hücre hatları gibi hücre hatları 24 saat içinde kuyunun dibinde spheroids oluşturur. 3Boyutlu bir hücresel mimarinin oluşmasıiçin küresel leri 48 saat daha kuluçkaya yatırın.Üçüncü gün, kollajen yerleştirin, 5X kültür orta, tek azılı sodyum hidroksit, ve buz üzerinde bir 20 mililitrelik tüp. Dikkatle ve yavaş yavaş soğutulmuş kültür tüpü içine soğuk kollajen 10.4 mililitre ekleyin. Kabarcıklar kaçının.Sonra, yavaşça soğuk steril 5X kültür orta 1,52 mililitre ekleyin. Kabarcıklar kaçının. Kullanımdan hemen önce, 72 mikrolitre soğuk steril tek molar sodyum hidroksit ekleyin ve çözeltiyi buzda tutun.Pipetleme ve kabarcıklar kaçınarak yavaşça karıştırın. Verimli karıştırma, ortamda kırmızıdan turuncu-kırmızıya doğru renk değişimine yol açar. Kullanıma kadar buz üzerinde karışımı bırakın.Daha sonra, ilk gün hazırlanan 96 kuyulu plakadan 190 mikrolitre süpernatant çıkarmak için kuyunun yan tarafına doğru bir açıyla bir pipet kullanın. Kuyunun dibinde oluşan küreselleri rahatsız etmemek için çok dikkatli olun. Yavaşça her kuyuya kollajen karışımı 100 mikrolitre ekleyin, kuyunun yan aşağı borulama.Kabarcıklar ve herhangi bir küresel rahatsızlık kaçının. Polimerizasyonu değerlendirmek için oda sıcaklığında 20 mililitrelik tüp içinde kalan kollajen karışımı tutun. Kollajenin polimerize olması için en az 10 dakika boyunca kuvözde plakayı kuluçkaya yatırın.Kalan kollajen yarı katı ve sünger gibi hale geldiğinde, küresel ler inhibitör ile tedavi edilmesi için hazır. 2X konsantrasyonunda inhibitörleri beş mililitre kültür ortamına ekleyin. Pipet 100 mikrolitre orta hafifçe her kuyunun yan aşağı küresel rahatsızlık önlemek için.İlaç aktivitesini değerlendirmek için her küresel spheroidi sıfır saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat gibi zamanlarda parlak alan mikroskobuyla gözlemleyin ve görüntüleyin. Sonra tabağı kuvöze geri ver. Şimdi, bir doku kültürü başlık plaka yerleştirin ve yavaşça 1X PBS 100 mikrolitre ile supernatant değiştirin.Küresel balığı rahatsız etmemeye dikkat edin ve kollajene dokunmaktan kaçının. Bu yıkama adımLarını üç kez daha tekrarlayın. Her kuyudaki son yıkamayı çıkarın ve 1X PBS'de %4 formaldehit 100 mikrolitre ile değiştirin.96 kuyulu plakayı bir laboratuvar bankına yerleştirin, folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında 24 saat bekletin. Ertesi gün formaldehiti dikkatlice çıkarın ve 1X PBS ile değiştirin. Bu yıkamayı üç kez daha tekrarlayın.Ardından, 1X PBS yıkamayı 100 mikrolitre taze hazırlanmış Triton X-100 çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Bu arada, 50 mililitrelik bir tüpte 50 mililitre ve %05 yağsız süt tozu ile blokaj çözeltisini hazırlayın ve iyice karıştırın.30 dakika sonra Triton X-100'ü çıkarın ve 1X PBS ile üç kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 1-100 oranında engelleme tampon anti-fare IgG asetillenmiş tubulin antikor seyreltmek.Birincil antikor bloke tampon karışımını 15, 682 kez beş dakika santrifüj edin. Her kuyudaki engelleme çözeltisini dikkatlice çıkarın ve tüpten tampon süpernatantı bloke eden antikor un 25 ila 50 mikrolitresini ekleyin. Bir saat oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka.Daha sonra, her kuyudan antikor çözeltisini çıkarın ve 1X PBS 100 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Herhangi bir ek floresan lekelere ek olarak önerilen konsantrasyonda bloke tampon ikincil antikor seyreltin. Yine, 15, 682 kez g beş dakika ikincil antikor solüsyonu santrifüj.Engelleme çözeltisini her kuyudan çıkarın ve ikincil antikor süpernatantının 25 ila 50 mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat karanlıkta kuluçkaya yat. İkincil antikor boya çözeltisini çıkarın ve her kuyuda 100 mikrolitre olan 1X PBS ile üç kez yıkayın.Cam bir kaydırak merkezine plastik 200 mikrolitrelik pipet ile emme ile tek tek kollajen fişleri dikkatlice kaldırın. Kollajen fişi kapsayacak şekilde uygun bir montaj bir damla ekleyin. Bir kapak kaymasını numunenin üzerine yerleştirin ve slaydı karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.Üç boyutlu küresel teknoloji kansere özgü ortamın daha fazla temsilcisi olduğu için ilaç-tümör etkileşimleri anlayışı nı ilerletmektedir. Bu çalışmada, potansiyel anti-veya pro-göç etkileri tespit edildi. Bu özellikle KNS42'de kontrol veya tedavi edilen küresel lerde göç olmadığı görülür.Hücre ölümü 10 mikromolar en yüksek inhibitör konsantrasyonu gözlendi. Nükleer parçalanma ve göç eden hücreler U251 hücrelerinde belirgindi. U251 hücre spheroidleri orijinal küresel uzak yayılan sivri vardı, artan inhibitör konsantrasyonu ile görünür hücrelerde hücre yuvarlama artan.KNS42'de çöken mikrotübüller ve nükleer parçalanma gözlendi. Tek hücreli sivri yaprak benzeri çıkıntılar KNS42 geçişini gösterir. En düşük inhibitör konsantrasyonu, bu fenotip telaffuz edildi ama artan inhibitör konsantrasyonu ile kayboldu.Hazır olana kadar tüm reaktifleri buzda bırakmak çok önemlidir. Aksi takdirde, kollajen tüm küresel lere eklendi önce polimerize başlar. Konfokal mikroskopi ile oluşturulan görüntüleri ölçmek için kapsam vardır, örneğin, hücre morfolojisi üzerinde migrastatik ilaçların etkilerini değerlendirmek için.İlk defa migrastatik inhibitör MI-192'nin mikrotübül asetilasyon düzeyleri üzerindeki etkisini doğrulamamıza ve bunu hücre göçü açısından daha fazla araştırmamıza olanak sağladı. Fiksasyon adımı için formaldehit ele alırken ekstra dikkat edilmelidir. Her zamanki sağlık ve güvenlik yönergeleri geçerlidir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...