Name: intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Nous tenons à remercier Ionis Pharmaceuticals d'avoir fourni les AsOs décrits dans l'article.

Toutes les procédures in vivo ont été effectuées dans le cadre des protocoles approuvés par le Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) qui suivent les lignes directrices énoncées par le guide des National Institutes of Health des États-Unis pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Préparation du matériel et des instruments
<ol><li>Préparer les cannulas guide spécial.<ol>
<li>Utilisez un outil rotatif avec roue de coupure (ou scie pointue) ...

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li><li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier:+CNS+delivery+of+small+molecules.">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).</li><li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers+in+health+and+disease.">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+the+blood-brain+barrier:+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches.">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li><li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier.">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li><li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation.">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).</li><li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor.">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions.">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li><li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides.">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li><li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple,+rapid,+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat.">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li><li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery.">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).</li><li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice.">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li><li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Malat1:+Its+physiological+and+pathophysiological+functions.">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li><li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Targeted+Therapeutics.">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).</li><li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models.">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li><li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotides:+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases.">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li><li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington's+Disease.">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders.">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li><li>Hach&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy:+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience.">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li><li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy.">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li></ol>

Le présent article montre une méthode puissante pour livrer des agents thérapeutiques directement dans le Rat CNS. En théorie, une technique similaire peut également être effectuée chez la souris, mais en raison de la plus petite taille, la méthode peut être plus difficile. Par conséquent, notre groupe effectue des injections intracerebroventricular (ICV) chez les souris pour l'administration de médicaments cNS, qui atteignent les mêmes objectifs par une voie d'administration différente. Cette méthode a ét...

Le système vasculaire du système nerveux central (SNC) a évolué en tant que régulateur critique de l'homéostasie, contrôlant le trafic des molécules, fournissant des nutriments et se débarrassant des déchets. Ce système est également la première ligne de défense contre les attaques d'agents pathogènes externes, grâce à une distribution dense de jonctions serrées le long des parois des cellules endothéliales. Ces jonctions serrées constituent un aspect de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Bien que le BBB permette le transport de molécules nécessaires pour répondre aux besoins en nutriments et en énergie (par exemple, ions, glucose), il limite également sélectivement le passage des agents pathogènes ainsi que des produits chimiques toxiques1,2,3.
Ironiquement, la même fonction protectrice du BBB qui limite le passage des agents pathogènes et des produits chimiques toxiques est également le principal obstacle à notre capacité d'accéder facilement au SNC avec des traitements thérapeutiques après administration systémique à l'organisme2, 4,5. Ce rôle de la BBB a incité le développement d'une pléthore de nouvelles technologies de distribution de médicaments et d'approches6.
Une façon de surmonter cet obstacle est d'injecter les médicaments directement dans le liquide céphalo-rachidien (CSF) qui perfuse continuellement à la fois le cerveau et la moelle épinière7,8,9,10. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour livrer avec succès des agents dans l'espace intrathécal lombaire en plaçant l'extrémité interne du cathéter complètement dans l'espace d'equina de cauda de la colonne vertébrale de rat. Une description de cette procédure a été précédemment publiée par Mazur et coll. elsewhere11.
Le protocole est très efficace et produit un taux de réussite supérieur à 90 % de la livraison d'oligonucléotide antisens (ASO) au SNC lorsqu'il est évalué par l'analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymérase (qPCR) du gène cible knockdown8. La procédure cause un inconfort minimal aux animaux, car 100% des rats survivent à la chirurgie et montrent un gonflement minimal autour de la plaie chirurgicale et aucun signe de détresse (par exemple, hyperactivité, déshydratation, encerclant, perte d'équilibre, diminution de l'apport alimentaire, et déshydratation) pendant l'observation postopératoire. Un autre avantage de la méthode décrite ici est qu'elle ne nécessite pas d'équipement coûteux, ni d'outils spéciaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc</td>
			<td></td>
			<td>8416-160Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab sticks</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>NO 1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td>
			<td>BD</td>
			<td>1ml TB Luer-Lok tip</td>
			<td>BD 302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in</td>
			<td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in</td>
			<td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td>
			<td>BD</td>
			<td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td>
			<td>BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E</td>
			<td>120V 1.2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>BD 305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Prescription required</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilizer</td>
			<td>Andersen Sterilizer INC.</td>
			<td>AN 74i, gas sterilizer</td>
			<td>AN 74i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>BD</td>
			<td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle</td>
			<td>BD 305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>STERILIZER MODELNO FST 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra veterranery product</td>
			<td></td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pocket Pro Pet Trimmer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CLP-9931 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone scrub</td>
			<td>PDI</td>
			<td></td>
			<td>S48050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml</td>
			<td>FE1306G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>disposable scalpel</td>
			<td>No. 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heating pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>Model # 1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1749T14</td>
			<td>LH-36233780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Towel drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors and forceps</td>
			<td>FST and Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>4-0 or 5-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool to make the Guide cannular</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Rotary tool (Dremel)</td>
			<td>14H446 (Mfr: EZ456)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter, Pk5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock cut off Wheel</td>
			<td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td>
			<td>1.5&#8221;, Pk2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grinding Wheel, Aluminum Oxide</td>
			<td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock Mandrel</td>
			<td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diamond wheel floor Tile</td>
			<td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosing catheter system</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-GCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Catheters</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-INC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-STY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une défense importante contre l'entrée d'agents potentiellement toxiques ou pathogènes du sang dans le système nerveux central (SNC). Cependant, son existence réduit considérablement l'accessibilité des agents thérapeutiques administrés par le Système au SNC. Une méthode pour surmonter cela, est d'injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien (CSF), contournant ainsi le BBB. Cela peut être fait par l'implantation d'un cathéter pour l'infusion continue à l'aide d'une pompe osmotique, ou pour la livraison de bolus unique. Dans cet article, nous décrivons un protocole chirurgical pour la livraison des oligonucléotides d'antisense ciblage de CNS (ASO) par l'intermédiaire d'un cathéter implanté directement dans l'espace d'equina de cauda de la colonne vertébrale adulte de rat. Comme résultats représentatifs, nous montrons l'efficacité d'une seule injection intrathécale bolus ASO (IT) par l'intermédiaire de ce système de cathétérique en faisant tomber l'ARN cible dans différentes régions du Rat CNS. La procédure est sûre, efficace et ne nécessite pas d'équipement coûteux ou d'outils chirurgicaux. La technique décrite ici peut être adaptée pour fournir des médicaments dans d'autres modalités ainsi.

En utilisant la méthode décrite ici, nous avons injecté deux groupes de rats femelles adultes (250 à 300 g; n - 10/groupe) avec soit un seul bolus de PBS salin tamponné par le phosphate ou 300 g d'ASO ciblant le long non-codage (linc) ARN Malat1; dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement l'ASO Malat1 comme un composé d'outils, parce que Malat1 est exprimé de façon omniprésente et à des niveaux élevés dans tous les tissus14, y compris le cer...

Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Ici, nous décrivons une méthode pour livrer des drogues au système nerveux central de rat en implantant un cathéter dans l'espace intrathécal lombaire de la colonne vertébrale. Nous nous concentrons sur la livraison des oligonucléotides d'antisens, bien que cette méthode soit appropriée pour la livraison d'autres modalités thérapeutiques aussi bien.

Livraison intrathécale d'Oligonucléotides antisens dans le système nerveux central de rat

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Ce protocole permet la livraison directe de thérapeutiques dans le système nerveux central du rat pour évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et l’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans les modèles de maladies du rat. Cette procédure est sûre, efficace et ne nécessite pas d’équipement coûteux ou d’outils chirurgicaux. Yi Chen et Yi Luo, chercheurs de mon laboratoire, démontreront la procédure.Pour préparer le guide spécial cannulas, utilisez un outil rotatif avec une roue coupée pour couper les deux extrémités d’une aiguille de calibre 19 pour obtenir une canule guide d’environ un mètre et demi à deux centimètres de long. Ensuite, utilisez la meule de l’outil rotatif pour lisser les deux extrémités. Pour préparer l’assemblage du fil de cathéter, couper un morceau de huit centimètres de long de tube PE10 de 011 pouces de diamètre pour servir de cathéter intrathecal pour chaque animal.Utilisez un stylo marqueur résistant à l’éthanol pour marquer deux centimètres d’une extrémité de chaque morceau de tube. Pour chaque animal, insérez un fil de stylet de 11 centimètres de long coupé à partir de fil en acier inoxydable recouvert de polytétrafluoroéthylène dans le lumen du cathéter PE10 de huit centimètres. Pour préparer l’assemblage du cathéter de livraison, couper un morceau de cathéter PE50 de 5 à 10 centimètres de diamètre et insérer un adaptateur de tubes de calibre 23 dans une extrémité du cathéter.Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 avec un moyeu coupé dans un morceau d’environ 0,5 centimètre de tube PE10 et connectez le tube PE10 à l’autre extrémité du cathéter. Pour préparer un assemblage guide canule-aiguille, placez une canule guide au-dessus de l’extrémité d’une aiguille de calibre 23. Avant de commencer la chirurgie, placez un coussin chauffant sur la table de chirurgie et couvrez le coussin avec une feuille de drapé stérile.Placez un tube de centrifugeuse conique de 50 mL sur la feuille et confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez le rat expérimental anesthésié. Après avoir pesé l’animal, raser le dos de la queue à la colonne thoracique caudale et placer le rat rasé sur la feuille stérile en position couchée. Placez le tube de 50mL sous l’abdomen pour fléchir la colonne vertébrale dans la région lombaire, et appliquez l’onguent ophtalmique aux yeux.Ensuite, injectez subcutanément un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue et nettoyez la peau exposée avec de la povidone séquentielle et des gommages d’alcool. Draper l’animal d’une feuille transparente stérile fenestrated. Pour le placement du cathéter et l’injection du composé, identifier les deux fosses naturelles entre les muscles au-dessus du bassin rasé, et avec une main tenant les fosses, utilisez l’autre main pour appuyer doucement et sentir la colonne vertébrale du caudal à la direction rostrale pour localiser la première indentation majeure entre les vertèbres.Après avoir identifié l’espace intervertébral entre les vertèbres S1 et L6, déplacez-vous légèrement rostrally pour identifier l’espace intervertébral entre les vertèbres L5 et L6. Utilisez un scalpel pour faire une incision d’au plus deux centimètres de long dans la peau et la capsule musculaire à cet endroit le long de la ligne médiane de la direction rostrale à caudale de sorte que le site d’injection sera au centre de l’incision. Utilisez des ciseaux de dissection pour disséquer le tissu conjonctif jusqu’à ce que la couche musculaire puisse être visualisée.Faire une incision d’un centimètre dans la capsule musculaire immédiatement latérale au processus spinal dorsal de la vertèbre lombaire L6. Placez l’assemblage de l’aiguille de canule guide près de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre lombaire et poussez l’assemblage dans l’espace intervertébral le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre de sorte que l’extrémité de l’aiguille pénètre dans le canal rachidien. Utilisez des forceps contondants pour localiser le processus rachidien dorsal de la vertèbre lombaire L6 puis poussez l’aiguille le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre dans l’espace des invertébraux.Poussez la canule guide en place le long de l’aiguille, retirez l’aiguille et insérez l’assemblage du fil de cathéter dans la canule du guide. La pêche au cathéter à un angle d’environ 45 degrés vers le canal rachidien force l’extrémité du cathéter à environ 0,3 centimètre dans le canal. Retirez le fil de stylet à environ 2,5 centimètres de la pointe intrathecale du cathéter et avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que le marquage de deux centimètres sur le cathéter soit juste visible sous le muscle.Lorsque le cathéter est en place, retirez la canule guide pour laisser le cathéter et le fil de stylet en place. Avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que la marque de deux centimètres soit à l’entrée du canal et retirez complètement le fil de stylet. Le liquide céphalo-rachidien peut être visualisé entrant dans le cathéter implanté.Connectez ensuite l’assemblage du cathéter de livraison à l’extrémité distale du cathéter implanté par l’intermédiaire de l’extrémité de l’aiguille de calibre 30. Ensuite, chargez 60 microlitres de solution saline stérile dans une seringue de 100 microlitres et chargez un bolus de 30 microlitres du composé d’essai dans une deuxième seringue. Connectez la seringue saline à l’extrémité de l’adaptateur de tubes de l’assemblage du cathéter de livraison et rincez 20 microlitres de solution saline stérile dans l’espace intrathecal.Lorsque toute la solution saline a été rincée, remplacez la seringue saline par la seringue chargée bolus et injectez 30 microlitres du composé d’essai dans l’espace intrathécal sur une période de 30 secondes. Lorsque tout le bolus a été livré, remplacer la seringue chargée de bolus par une autre seringue saline chargée et rincer le cathéter avec 40 microlitres supplémentaires de solution saline. Lorsque le deuxième volume de solution saline a été livré, détachez l’assemblage du cathéter de livraison du cathéter implanté et utilisez une paire de forceps de dissection stérilisés par la chaleur très chaude pour sévir contre le tube pour couper et sceller à la chaleur le cathéter implanté.Utilisez des sutures de monofilament absorbables pour fixer le cathéter scellé à la chaleur vers le tissu conjonctif, puis utilisez des sutures non absorbables pour fermer la peau. Ensuite, utilisez de la gaze et de la solution saline pour laver le sang de la peau et placer le rat dans un incubateur chauffé avec surveillance jusqu’à la pleine récomprégence. Dans cette expérience représentative, le knockdown très bon a été obtenu dans toutes les régions rassemblées après la livraison unique d’oligonucléotide de bolus antisense comme démontré.Cependant, un certain degré de variabilité régionale a été mesuré avec la moelle épinière présentant le pourcentage le plus élevé de knockdown. Après une injection réussie de l’oligonucléotide antisens, ou d’autres thérapeutiques, dans un modèle approprié, on peut évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique, et l’efficacité des thérapeutiques.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Drug Delivery systémique et locale pour traiter les maladies du système nerveux central dans les modèles rongeurs

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Recherche

Neurosciences

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...