Name: intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

אנחנו רוצים להודות Ionis פרמצבטיקה על אספקת אסוס המתואר במאמר.

כל בהליכים vivo בוצעו תחת השימוש המוסדי Biogen בעלי חיים והוועדה טיפול (IACUC) מאושר פרוטוקולים אשר לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו על ידי ארצות הברית הלאומי המכון לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת חומרים וכלים
<ol><li>הכינו את הצינורית המיוחדת למדריך.<ol>
<li>השתמש בכלי רוטרי עם ...

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li><li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier:+CNS+delivery+of+small+molecules.">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).</li><li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers+in+health+and+disease.">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+the+blood-brain+barrier:+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches.">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li><li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier.">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li><li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation.">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).</li><li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor.">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions.">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li><li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides.">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li><li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple,+rapid,+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat.">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li><li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery.">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).</li><li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice.">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li><li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Malat1:+Its+physiological+and+pathophysiological+functions.">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li><li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Targeted+Therapeutics.">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).</li><li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models.">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li><li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotides:+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases.">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li><li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington's+Disease.">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders.">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li><li>Hach&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy:+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience.">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li><li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy.">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li></ol>

המאמר הנוכחי מראה שיטה רבת עוצמה כדי לספק סוכנים טיפוליים ישירות לתוך ה-CN של החולדה. בתאוריה, טכניקה דומה יכולה להתבצע גם בעכברים, אם כי במידה הקטנה יותר, השיטה יכולה להיות מאתגרת יותר. לכן, הקבוצה שלנו מבצעת הזרקת המוח התאיים (ICV) בעכברים עבור העברת תרופות ה-CN, המגיעות לאותן מטרות באמצעות תו?...

מערכת כלי הדם של מערכת העצבים המרכזית (CN) התפתחה כרגולטור קריטי של הומאוסטזיס, שליטה על התנועה של מולקולות, אספקת חומרים מזינים ולהיפטר פסולת. מערכת זו היא גם קו ההגנה הראשון מפני תקיפות של פתוגנים חיצוניים, הודות לחלוקה צפופה של צמתים הדוקים לאורך קירות התאים האנדותל. הצמתים הצמודים האלה מפצות על היבט אחד של מחסום מוח הדם (BBB). בעוד bbb מאפשר את ההובלה של מולקולות הדרושות כדי להגשים דרישות התזונתיים והאנרגיה (g., יוני, גלוקוז), זה גם מגביל באופן סלקטיבי את המעבר של פתוגנים, כמו גם כימיקלים רעילים1,2,3.
באופן אירוני, אותו תפקיד מגן של BBB כי מגביל מעבר של פתוגנים וכימיקלים רעילים גם הוא המכשול העיקרי ליכולתנו לגשת בקלות את ה-CN עם טיפולים טיפוליים לאחר הממשל מערכתית לאורגניזם2, 4,5. תפקיד זה של BBB מבקש פיתוח של שפע של טכנולוגיות חדשות להפצת סמים וגישות6.
אחת הדרכים להתגבר על מכשול זה היא להזריק את התרופות ישירות לתוך הנוזל המוחי-שדרתי (שדרתי) כי ברציפות הן המוח והן חוט השדרה7,8,9,10. במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי לספק בהצלחה סוכנים לתוך החלל המותני המותניים על ידי הצבת הקצה הפנימי של הקטטר לחלוטין בחלל תסמונת זנב של עמוד השדרה חולדה. תיאור של הליך זה פורסם בעבר על ידי מזור ואח'.
הפרוטוקול הוא יעיל מאוד ומייצרת גדול מ 90% שיעור הצלחה של antilig, משלוח כמותי (ה-ASO) המסירה ל-CN כאשר מוערך על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ניתוח של היעד הגנטי הסתרה8. ההליך גורם אי-נוחות מינימלית לבעלי החיים, כמו 100% של חולדות לשרוד את הניתוח ולהראות נפיחות מינימלית סביב הפצע כירורגי ואין סימנים של מצוקה (למשל, היפראקטיביות, התייבשות, מקיפים, אובדן של איזון, ירידה צריכת המזון, ו התייבשות) במהלך התבוננות שלאחר ניתוח. יתרון נוסף של השיטה המתוארת כאן הוא שהוא אינו דורש ציוד יקר, או כלים מיוחדים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc</td>
			<td></td>
			<td>8416-160Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab sticks</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>NO 1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td>
			<td>BD</td>
			<td>1ml TB Luer-Lok tip</td>
			<td>BD 302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in</td>
			<td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in</td>
			<td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td>
			<td>BD</td>
			<td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td>
			<td>BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E</td>
			<td>120V 1.2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>BD 305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Prescription required</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilizer</td>
			<td>Andersen Sterilizer INC.</td>
			<td>AN 74i, gas sterilizer</td>
			<td>AN 74i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>BD</td>
			<td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle</td>
			<td>BD 305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>STERILIZER MODELNO FST 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra veterranery product</td>
			<td></td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pocket Pro Pet Trimmer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CLP-9931 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone scrub</td>
			<td>PDI</td>
			<td></td>
			<td>S48050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml</td>
			<td>FE1306G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>disposable scalpel</td>
			<td>No. 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heating pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>Model # 1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1749T14</td>
			<td>LH-36233780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Towel drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors and forceps</td>
			<td>FST and Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>4-0 or 5-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool to make the Guide cannular</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Rotary tool (Dremel)</td>
			<td>14H446 (Mfr: EZ456)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter, Pk5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock cut off Wheel</td>
			<td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td>
			<td>1.5&#8221;, Pk2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grinding Wheel, Aluminum Oxide</td>
			<td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock Mandrel</td>
			<td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diamond wheel floor Tile</td>
			<td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosing catheter system</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-GCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Catheters</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-INC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-STY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system

מחסום מוח הדם (BBB) הוא הגנה חשובה מפני הכניסה של גורמים רעילים או גורמי הרסניות מהדם אל מערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, קיומה גם מוריד באופן דרמטי את הנגישות של סוכנים רפואיים מנוהלים בצורה מערכתית ל-CN. שיטה אחת להתגבר על זה, היא להזריק את הסוכנים האלה ישירות לתוך הנוזל השדרתי (שדרתי), ובכך לעקוף את BBB. זה יכול להיעשות באמצעות השרשה של קטטר עבור אינפוזיה רציפה באמצעות משאבת אוסמוטי, או עבור משלוח בודד. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול כירורגי למסירה של מערכת היעד האנטי הגיונית פורוזימטר (אסוס) באמצעות קטטר מושתל ישירות לחלל תסמונת זנב של עמוד השדרה למבוגרים חולדה. כתוצאות מייצגות, אנו מראים את היעילות של בודד באמצעות הזרקת הרכב (IT) באמצעות המערכת הזאת מערכת להפיל את RNA היעד באזורים שונים של ה-CN של החולדה. ההליך הוא בטוח, יעיל ואינו דורש ציוד יקר או כלים כירורגיים. ניתן להתאים את הטכניקה המתוארת כאן לאספקת סמים גם באופנים אחרים.

באמצעות השיטה המתוארת כאן, הזרקנו שתי קבוצות של חולדות נשים בוגרות (250-300 גרם; n = 10/קבוצה) עם מנת אחת של מלוחים באגירה של פוספט-PBS או 300 μg של ASO מיקוד ארוך שאינו קידוד (לינק) RNA Malat1; במעבדה שלנו אנו משתמשים באופן שגרתי Malat1 ASO כמו מתחם כלי, כי Malat1 מתבטאת אוביקוויטיות ברמות גבוהות ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

כאן, אנו מתארים שיטה להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית העכברוש על ידי שתילת קטטר לתוך החלל המותני הפנימי של עמוד השדרה. אנו מתמקדים במסירת מחלת האנטי-הגיונית, למרות ששיטה זו מתאימה גם לאספקה של שיטות טיפוליות אחרות.

משלוח פנימי של אנטי-סנס וליגונו, במערכת העצבים המרכזית של חולדה

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

פרוטוקול זה מאפשר אספקה ישירה של טיפולים למערכת העצבים המרכזית של החולדה כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה, הפרמקודינמיקה והיעילות של טיפולים חדשניים במודלים של מחלות עכברושים. הליך זה בטוח, יעיל ואינו דורש ציוד יקר או כלים כירורגיים. הדגמת ההליך יהיו יי חן יי לואו, מדעני מחקר מהמעבדה שלי.כדי להכין את המדריך המיוחד cannulas, להשתמש בכלי סיבובי עם גלגל לחתוך כדי לחתוך את שני הקצוות של מחט מד 19 כדי לקבל בערך אחד וחצי עד שני סנטימטר ארוך מדריך cannula. לאחר מכן השתמש בגלגל השחזה של הכלי הסיבובי כדי להחליק את שני הקצוות. כדי להכין את מכלול חוט הקטטר, לחתוך חתיכה אחת באורך שמונה ס"מ של צינורות PE10 בקוטר 011 אינץ 'כדי לשמש קטטר תוך-פתקל עבור כל בעל חיים.השתמש בעט סמן עמיד באתנול כדי לסמן שני סנטימטרים מקצה אחד של כל פיסת צינורות. עבור כל חיה, הכנס חוט 11 ס"מ ארוך סגנון לחתוך מ polytetrafluoroethylene מצופה חוט נירוסטה לתוך הלומן של קטטר PE10 שמונה ס"מ. כדי להכין את מכלול קטטר המסירה, לחתוך חתיכה של חמישה עד 10 ס"מ 023 אינץ ' קוטר PE50 קטטר ולהכניס מתאם צינורות מד 23 לתוך קצה אחד של הקטטר.לאחר מכן הכנס מחט 30 מד עם רכזת חתוכה לחתיכה כ 0.5 ס"מ של צינורות PE10 ולחבר את צינורות PE10 לקצה השני של הקטטר. כדי להכין הרכבה מדריך מחט cannula, מניחים cannula מדריך על קצה של מחט 23 מד. לפני תחילת הניתוח, מניחים כרית חימום על שולחן הניתוחים ומכסים את הפנקס עם גיליון וילון סטרילי.מניחים צינור צנטריפוגה חרוט 50mL על הסדין ולאשר חוסר תגובה קמצוץ הבוהן בחולדה ניסיונית הרדמה. לאחר שקילה של החיה, לגלח את הגב מהזנב אל עמוד השדרה החזי caudal ולהמקם את החולדה מגולחת על הסדין הסטרילי במצב נוטה. מקם את צינור 50mL מתחת לבטן כדי להגמיש את עמוד השדרה באזור המותני, ולהחיל משחה עיניים על העיניים.לאחר מכן, להזריק תת עורית מיליגרם אחד לקילוגרם של Buprenorphine שחרור מתמשך ולנקות את העור החשוף עם povidone רציף וקרצוף אלכוהול. עוטף את החיה עם סדין שקוף סטרילי. למיקום הקטטר והזרקת המתחם, זהה את שני הבורות הטבעיים בין השרירים שמעל האגן המגולח, וביד אחת החזקת הבורות, השתמש ביד השנייה כדי ללחוץ בעדינות ולהרגיש את עמוד השדרה מן caudal לכיוון rostral כדי לאתר את הכניסה הגדולה הראשונה בין החוליות.לאחר זיהוי הרווח הבין חולייתי בין חוליות S1 ו- L6, לנוע מעט rostrally כדי לזהות את החלל הבין חולייתי בין חוליות L5 ו L6 חוליות. השתמש אזמל לעשות חתך ארוך לא יותר משני סנטימטר בעור ובקפסולה שרירים באתר זה לאורך קו האמצע מן rostral לכיוון caudal, כך אתר ההזרקה יהיה במרכז החתך. השתמש מספריים ניתוח לנתח את רקמת החיבור עד שכבת השריר ניתן לדמיין.בצע חתך של סנטימטר אחד בקפסולת השריר מיד בצלבי לתהליך עמוד השדרה הגבי של חוליית המותני L6. מקם את מכלול מחט המדריך ליד ההיבט הראשון של החוליה המותנית השישית ודחוף את ההרכבה לחלל הבין חולייתי לאורך ההיבט הראשון של החוליה השישית כך שסוף המחט חודר לתעלת עמוד השדרה. השתמש מדחפים קהה כדי לאתר את תהליך עמוד השדרה הגבי של חוליית המותני L6 ואז לדחוף את המחט לאורך ההיבט הראשון של החוליה השישית לתוך החלל invertebrata.לדחוף את המדריך cannula במקום לאורך המחט, להסיר את המחט, ולהכניס את הרכבת חוט קטטר לתוך cannula מדריך. הריסת הקטטר בזווית של כ-45 מעלות לתעלת עמוד השדרה, כפתה את קצה הקטטר כ-0.3 ס"מ לתוך התעלה. הסר את חוט הסגנון כ -2.5 ס"מ מהטיפ התוך-תת-תאי של הקטטר וקדם את הקטטר לתעלת עמוד השדרה עד שסימון שני הס"מ על הקטטר נראה ממש מתחת לשריר.כאשר הקטטר נמצא במקום, להסיר את המדריך cannula להשאיר את קטטר חוט סגנון במקום. מקדמים את הקטטר לתעלת עמוד השדרה עד שסימן שני סנטימטרים נמצא בכניסה לתעלה ומושכים לחלוטין את חוט הסגנון. נוזל השדרה המוחי עשוי להיות חזותי נכנס קטטר מושתל.לאחר מכן חבר את מכלול קטטר המסירה לקצה הדיסטלי של הקטטר המושתל דרך קצה המחט 30 מד. לאחר מכן, לטעון 60 microliters של מלוחים סטריליים לתוך מזרק 100 microliter ולהעמיס בולוס של 30 microliters של תרכובת הבדיקה לתוך מזרק שני. חבר את מזרק מלוחים לקצה מתאם צינורות של הרכבה קטטר משלוח לשטוף 20 microliters של מלוחים סטריליים לתוך החלל התוך-תיאה.כאשר כל תמיסת מלח כבר סמוק, להחליף את מזרק מלוחים עם מזרק טעון בולוס ולהזריק 30 microliters של תרכובת הבדיקה לתוך החלל התוך-תיאה על פני תקופה של 30 שניות. כאשר כל הבולוס נמסר, להחליף את המזרק טעון בולוס עם מזרק טעון מלוחים אחר לשטוף את הקטטר עם 40 microliters נוספים של מלוחים. כאשר הנפח השני של מלוחים נמסר, לנתק את הרכבה קטטר משלוח מן קטטר מושתל ולהשתמש בזוג מלקחיים מאוד חם חום מעוקר ניתוח כדי להדק על הצינור לחתוך באופן בלתי מתאים ולאטום את הקטטר המושתל.השתמש תפרים monofilament לספוג כדי לאבטח את קטטר אטום בחום לרקמת החיבור ולאחר מכן להשתמש תפרים nonabsorbable כדי לסגור את העור. לאחר מכן השתמש גזה מלוחים לשטוף כל דם מן העור ולה מניחים את החולדה באינקובטור מחומם עם ניטור עד הגינות מלאה. בניסוי מייצג זה, נוקאאוט טוב מאוד הושג בכל האזורים שנאספו לאחר משלוח אחד של בולוס אנטיסנס אוליגונוקלאוטיד כפי שהוכח.עם זאת, מידה מסוימת של שונות אזורית נמדדה כאשר חוט השדרה מציג את האחוז הגבוה ביותר של הפלה. לאחר זריקה מוצלחת של אוליגונוקלאוטיד antisense, או טיפולים אחרים, לתוך מודל מתאים, אפשר להעריך את פרמקוקינטיקה, פרמקודינמיקה, ויעילות של טיפולי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...