Name: intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Ionis Pharmaceuticals per la fornitura degli ASO descritti nell'articolo.

Tutte le procedure in vivo sono state eseguite nell'ambito di protocolli approvati da Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) che seguono le linee guida stabilite dalla Guida dei National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione di materiali e strumenti
<ol><li>Preparare le cannule guida speciale.<ol>
<li>Utilizzare un utensile rotante con ruota di taglio (o una sega affilata) per tagliare le due estremità di...

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li><li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier:+CNS+delivery+of+small+molecules.">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).</li><li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers+in+health+and+disease.">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+the+blood-brain+barrier:+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches.">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li><li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor.">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions.">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li><li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides.">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li><li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple,+rapid,+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat.">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li><li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery.">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).</li><li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice.">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li><li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Malat1:+Its+physiological+and+pathophysiological+functions.">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li><li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Targeted+Therapeutics.">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).</li><li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models.">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li><li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotides:+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases.">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li><li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington's+Disease.">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders.">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li><li>Hach&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy:+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience.">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li><li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy.">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li></ol>

Il presente articolo mostra un potente metodo per fornire agenti terapeutici direttamente nel ratto CNS. In teoria, una tecnica simile può essere eseguita anche nei topi, anche se a causa delle dimensioni più piccole, il metodo può essere più impegnativo. Pertanto, il nostro gruppo esegue iniezioni intracerebroventricoculari (ICV) nei topi per la somministrazione di farmaci CNS, che raggiungono gli stessi obiettivi attraverso una diversa via di somministrazione. Tale metodo è stato descritto in un altro studio<sup c...

Il sistema vascolare del sistema nervoso centrale (SNC) si è evoluto come regolatore critico dell'omeostasi, controllando il traffico di molecole, fornendo nutrienti e eliminando i rifiuti. Questo sistema è anche la prima linea di difesa dagli attacchi di agenti patogeni esterni, grazie ad una distribuzione densa di giunzioni strette lungo le pareti delle cellule endoteliali. Queste giunzioni strette costituiscono un aspetto della barriera ematoencefalica (BBB). Mentre il BBB consente il trasporto di molecole necessarie per soddisfare la domanda di nutrienti ed energia (ad esempio, ioni, glucosio), limita anche selettivamente il passaggio di agenti patogeni e sostanze chimiche tossiche1,2,3.
Ironia della sorte, la stessa funzione protettiva della BBB che limita il passaggio di patogeni e sostanze chimiche tossiche è anche il principale ostacolo alla nostra capacità di accedere facilmente al SNC con trattamenti terapeutici dopo la somministrazione sistemica all'organismo2, 4,5. Questo ruolo della BBB ha stimolato lo sviluppo di una pletora di nuove tecnologie di distribuzione di farmaci e si avvicina a6.
Un modo per superare questo ostacolo è quello di iniettare i farmaci direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) che continuamente perfonde sia il cervello che il midollo spinale7,8,9,10. In questo articolo, descriviamo un metodo per consegnare con successo gli agenti nello spazio lombare intrathecal posizionando l'estremità interna del catetere completamente nello spazio cauda equina della colonna vertebrale del ratto. Una descrizione di questa procedura è stata precedentemente pubblicata da Mazur et al.
Il protocollo è molto efficace e produce un tasso di successo superiore al 90% della consegna di oligonucleotidi antisenso (ASO) al SNC quando valutato dall'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) del knockdown del gene bersaglio8. La procedura provoca un disagio minimo per gli animali, poiché il 100% dei ratti sopravvive all'intervento e mostra un minimo gonfiore intorno alla ferita chirurgica e nessun segno di disagio (ad esempio, iperattività, disidratazione, circolare, perdita di equilibrio, diminuzione dell'assunzione di cibo e disidratazione) durante l'osservazione post-operatoria. Un altro vantaggio del metodo qui descritto è che non richiede attrezzature costose, né strumenti speciali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc</td>
			<td></td>
			<td>8416-160Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab sticks</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>NO 1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td>
			<td>BD</td>
			<td>1ml TB Luer-Lok tip</td>
			<td>BD 302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in</td>
			<td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in</td>
			<td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td>
			<td>BD</td>
			<td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td>
			<td>BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E</td>
			<td>120V 1.2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>BD 305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Prescription required</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilizer</td>
			<td>Andersen Sterilizer INC.</td>
			<td>AN 74i, gas sterilizer</td>
			<td>AN 74i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>BD</td>
			<td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle</td>
			<td>BD 305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>STERILIZER MODELNO FST 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra veterranery product</td>
			<td></td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pocket Pro Pet Trimmer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CLP-9931 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone scrub</td>
			<td>PDI</td>
			<td></td>
			<td>S48050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml</td>
			<td>FE1306G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>disposable scalpel</td>
			<td>No. 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heating pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>Model # 1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1749T14</td>
			<td>LH-36233780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Towel drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors and forceps</td>
			<td>FST and Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>4-0 or 5-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool to make the Guide cannular</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Rotary tool (Dremel)</td>
			<td>14H446 (Mfr: EZ456)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter, Pk5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock cut off Wheel</td>
			<td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td>
			<td>1.5&#8221;, Pk2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grinding Wheel, Aluminum Oxide</td>
			<td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock Mandrel</td>
			<td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diamond wheel floor Tile</td>
			<td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosing catheter system</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-GCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Catheters</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-INC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-STY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system

La barriera ematoencefalica (BBB) è un'importante difesa contro l'ingresso di agenti potenzialmente tossici o patogeni dal sangue al sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, la sua esistenza riduce drasticamente anche l'accessibilità di agenti terapeutici amministrati sistemicamente al SNC. Un metodo per superare questo, è quello di iniettare tali agenti direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF), bypassando così il BBB. Questo può essere fatto tramite l'impianto di un catetere per l'infusione continua utilizzando una pompa osmotica, o per la consegna di un singolo bolus. In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la consegna di oligonucleotidi antisenso (AsO) mirati al SNC tramite un catetere impiantato direttamente nello spazio cauda equina della colonna vertebrale del ratto adulto. Come risultati rappresentativi, mostriamo l'efficacia di una singola iniezione intratecala (IT) di bolus attraverso questo sistema di cateterizzazione nell'abbattere l'RNA bersaglio in diverse regioni del ratto CNS. La procedura è sicura, efficace e non richiede attrezzature costose o strumenti chirurgici. La tecnica qui descritta può essere adattata per fornire farmaci anche in altre modalità.

Usando il metodo descritto qui, abbiamo iniettato due gruppi di ratti femmine adulti (250-300 g; n - 10/gruppo) con un singolo bolfo di PBS salina bufferizzato di fosfato o 300 g di ASO che prendono di mira il lungo RNA Malat1 non codificante (linc); nel nostro laboratorio usiamo abitualmente il Malat1 ASO come composto di utensili, perché Malat1 è espresso onnipresente e ad alti livelli in tutti i tessuti14, compresi cervello e midollo spinale. L'ASO Malat1 funz...

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Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Qui, descriviamo un metodo per fornire farmaci al sistema nervoso centrale del ratto impiantando un catetere nello spazio lombare intrateco della colonna vertebrale. Ci concentriamo sulla consegna di oligonucleotidi antisenso, anche se questo metodo è adatto per la consegna di altre modalità terapeutiche pure.

Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Questo protocollo consente la somministrazione diretta di terapie nel sistema nervoso centrale del ratto per valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia di nuove terapie nei modelli di malattia del ratto. Questa procedura è sicura, efficace e non richiede attrezzature costose o strumenti chirurgici. A dimostrare la procedura saranno Yi Chen e Yi Luo, ricercatori del mio laboratorio.Per preparare le speciali cannule guida, utilizzare uno strumento rotante con una ruota tagliata per tagliare entrambe le estremità di un ago calibro 19 per ottenere una cannula guida lunga circa uno e mezzo o due centimetri. Quindi utilizzare la mola dell'utensile rotante per levigare entrambe le estremità. Per preparare l'assemblaggio del filo del catetere, tagliare un pezzo lungo otto centimetri di tubi PE10 di 011 pollici di diametro per fungere da catetere intratecale per ogni animale.Utilizzare una penna marcatore resistente all'etanolo per ottenere un segno a due centimetri da un'estremità di ogni pezzo di tubo. Per ogni animale, inserire un filo di stylet lungo 11 centimetri tagliato dal filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene nel lume del catetere PE10 di otto centimetri. Per preparare l'assemblaggio del catetere di consegna, tagliare un pezzo di catetere PE50 da cinque a 10 centimetri di diametro 023 pollici e inserire un adattatore tubo di 23 calibri in un'estremità del catetere.Quindi inserire un ago calibro 30 con un mozzo tagliato in un pezzo di tubi PE10 di circa 0,5 centimetri e collegare il tubo PE10 all'altra estremità del catetere. Per preparare un assemblaggio di cannula-ago guida, posizionare una cannula guida all'estremità di un ago calibro 23. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, posizionare una pastiglia riscaldante sul tavolo dell'intervento chirurgico e coprire il pad con un foglio di drappo sterile.Posizionare un tubo di centrifuga conica da 50 ml sul foglio e confermare la mancanza di risposta al pizzico nel ratto sperimentale anestetizzato. Dopo aver pesato l'animale, radere la schiena dalla coda alla colonna vertebrale toracica caudale e posizionare il ratto rasato sul foglio sterile in posizione prona. Posizionare il tubo da 50 ml sotto l'addome per flettere la colonna vertebrale nella regione lombare e applicare un unguento oftalmico agli occhi.Successivamente, iniettare per via sottocutanea un milligrammo per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato e pulire la pelle esposta con povidone sequenziale e scrub alcool. Drappeggiare l'animale con un foglio trasparente sterile fenestrato. Per il posizionamento del catetere e l'iniezione del composto, identificare le due fosse naturali tra i muscoli sopra il bacino rasato e, con una mano che tiene le fosse, utilizzare l'altra mano per premere delicatamente e sentire la colonna vertebrale dalla direzione caudale a quella rostrale per individuare la prima indentazione principale tra le vertebre.Dopo aver identificato lo spazio intervertebrale tra le vertebre S1 e L6, muoversi leggermente rostralmente per identificare lo spazio intervertebrale tra le vertebre L5 e L6. Usa un bisturi per fare un'incisione lunga non più di due centimetri nella pelle e nella capsula muscolare in questo sito lungo la linea mediana dalla direzione rostrale a quella caudale in modo che il sito di iniezione sia al centro dell'incisione. Utilizzare le forbici di dissezione per sezionare il tessuto connettivo fino a quando lo strato muscolare non può essere visualizzato.Fare un'incisione di un centimetro nella capsula muscolare immediatamente laterale al processo spinale dorsale della vertebra lombare L6. Posizionare l'assemblaggio dell'ago della cannula guida vicino all'aspetto anteriore della sesta vertebra lombare e spingere l'assemblaggio nello spazio intervertebrale lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra in modo che l'estremità dell'ago penetri nel canale spinale. Utilizzare pini smussati per localizzare il processo spinale dorsale della vertebra lombare L6, quindi spingere l'ago lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra nello spazio invertebrata.Spingere la cannula guida in posizione lungo l'ago, rimuovere l'ago e inserire l'assemblaggio del filo del catetere nella cannula guida. Inclinando il catetere con un angolo di circa 45 gradi rispetto al canale spinale, forzare l'estremità del catetere di circa 0,3 centimetri nel canale. Rimuovere il filo di stile a circa 2,5 centimetri dalla punta intratecale del catetere e far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando la marcatura dei due centimetri sul catetere è appena visibile sotto il muscolo.Quando il catetere è in posizione, rimuovere la cannula guida per lasciare il catetere e il filo di stile in posizione. Far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando il segno dei due centimetri è all'ingresso del canale e ritirare completamente il filo di stile. Il fluido spinale cerebrale può essere visualizzato entrando nel catetere impiantato.Quindi collegare il gruppo del catetere di erogazione all'estremità distale del catetere impiantato tramite l'estremità dell'ago calibro 30. Successivamente, caricare 60 microlitri di soluzione salina sterile in una siringa da 100 microlitri e caricare un bolo di 30 microlitri del composto in esame in una seconda siringa. Collegare la siringa salina all'estremità dell'adattatore di tubazione dell'assieme del catetere di erogazione e sciacquare 20 microlitri di soluzione salina sterile nello spazio intratecale.Una volta che tutta la salina è stata lavata, sostituire la siringa salina con la siringa caricata con bolo e iniettare 30 microlitri del composto in esame nello spazio intratecale per un periodo di 30 secondi. Una volta che tutto il bolo è stato consegnato, sostituire la siringa caricata di bolo con un'altra siringa caricata salina e sciacquare il catetere con altri 40 microlitri di soluzione salina. Una volta consegnato il secondo volume di soluzione salina, staccare il gruppo del catetere di erogazione dal catetere impiantato e utilizzare un paio di pinze di dissezione sterilizzate termicamente molto calde per bloccare il tubo per tagliare e sigillare termicamente il catetere impiantato.Utilizzare suture monofilamento assorbibili per fissare il catetere termo-sigillato al tessuto connettivo e quindi utilizzare suture non assorbibili per chiudere la pelle. Quindi utilizzare garza e soluzione salina per lavare il sangue dalla pelle e posizionare il topo in un'incubatrice riscaldata con monitoraggio fino alla piena ricompitenza. In questo esperimento rappresentativo, un'ottima abbattimento è stata ottenuta in tutte le regioni raccolte dopo la consegna di oligonucleotide antisense singolo bolo come dimostrato.Tuttavia, è stato misurato un certo grado di variabilità regionale con il midollo spinale che presenta la più alta percentuale di abbattimento. Dopo un'iniezione riuscita dell'oligonucleotide antisense, o altre terapie, in un modello appropriato, si possono valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia delle terapie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Ricerca

Neuroscienze

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

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Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

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In vivo Interrogatorio del Sistema Nervoso Centrale Translatome da Polyribosome Frazionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

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