Name: intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Ionis Pharmaceuticals for å forsyne ASOs beskrevet i artikkelen.

Alle in vivo prosedyrer ble utført under Biogen institusjonelle Animal use og Care Committee (IACUC) godkjente protokoller som følger retningslinjene fastsatt av USAs National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. material-og instrument klargjøring
<ol><li>Forbered spesielle guide kanyler.<ol>
<li>Bruk et roterende verktøy med cut-off hjul (eller en skarp sag) til å skjære av de to endene av en 19 G nål, noe som resulterer i en ~ 1.5 − 2 cm lang guide kany...

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li><li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier:+CNS+delivery+of+small+molecules.">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).</li><li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers+in+health+and+disease.">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+the+blood-brain+barrier:+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches.">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li><li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier.">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li><li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation.">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).</li><li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor.">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions.">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li><li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides.">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li><li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple,+rapid,+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat.">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li><li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery.">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).</li><li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice.">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li><li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Malat1:+Its+physiological+and+pathophysiological+functions.">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li><li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Targeted+Therapeutics.">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).</li><li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models.">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li><li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotides:+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases.">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li><li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington's+Disease.">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders.">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li><li>Hach&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy:+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience.">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li><li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy.">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li></ol>

Den nåværende artikkelen viser en kraftig metode for å levere terapeutiske midler direkte inn i rotte CNS. I teorien kan en lignende teknikk også utføres i mus, men på grunn av mindre størrelse, kan metoden være mer utfordrende. Derfor vår gruppe utfører intracerebroventrikulært (ICV) injeksjoner i mus for CNS narkotika levering, som når de samme målene gjennom en annen administrasjonsvei. Denne metoden er beskrevet i en annen studie16.
Fordelen med metoden...

Det vaskulære systemet i sentralnervesystemet (CNS) har utviklet seg som en kritisk regulator av homeostase, kontrollerende trafikk av molekyler, forsyne næringsstoffer og bli kvitt avfall. Dette systemet er også den første forsvarslinjen fra angrep av eksterne patogener, takket være en tett fordeling av tette veikryss langs veggene i de endothelial cellene. Disse stramme veikryss utgjør ett aspekt av blod hjerne barrieren (BBB). Mens BBB tillater transport av molekyler som kreves for å oppfylle nærings-og energibehov (f. eks, ioner, glukose), det også selektivt begrenser passering av patogener samt giftige kjemikalier1,2,3.
Ironisk nok, den samme beskyttende funksjon av BBB som begrenser passering av patogener og giftige kjemikalier er også det store hinderet for vår evne til å enkelt få tilgang til CNS med terapeutiske behandlinger etter systemisk administrasjon til organismen2, 4,5. Denne rollen av BBB har bedt om utvikling av en overflod av nye stoffet distribusjon teknologier og tilnærminger6.
En måte å overvinne denne hindringen er å injisere narkotika direkte inn i spinalvæsken (CSF) som kontinuerlig perfuses både hjernen og ryggmargen7,8,9,10. I denne artikkelen beskriver vi en metode for å kunne levere agenter i korsryggen intratekal plass ved å plassere den interne enden av kateteret helt i cauda equina plass på rotte ryggraden. En beskrivelse av denne prosedyren ble tidligere utgitt av Mazur et al. andre steder11.
Protokollen er svært effektiv og gir en større enn 90% suksess rate på antisens oligonukleotid (ASO) levering til CNS når det vurderes ved kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (qPCR) analyse av målet genet knockdown8. Fremgangsmåten medfører minimal ubehag å dyrene, idet 100% av rottene overleve det kirurgi og viser minimal heve seg i nærheten det inngrep sår og nei underskriver av smerte (e.g., hyperaktivitet, dehydrering, sirkle, tap av balanse, avtatt næringen inntak, og dehydrering) under post-op observasjon. En annen fordel med metoden er beskrevet her er at det ikke krever dyrt utstyr, eller noen spesielle verktøy.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc</td>
			<td></td>
			<td>8416-160Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab sticks</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>NO 1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td>
			<td>BD</td>
			<td>1ml TB Luer-Lok tip</td>
			<td>BD 302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in</td>
			<td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in</td>
			<td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td>
			<td>BD</td>
			<td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td>
			<td>BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E</td>
			<td>120V 1.2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>BD 305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Prescription required</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilizer</td>
			<td>Andersen Sterilizer INC.</td>
			<td>AN 74i, gas sterilizer</td>
			<td>AN 74i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>BD</td>
			<td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle</td>
			<td>BD 305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>STERILIZER MODELNO FST 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra veterranery product</td>
			<td></td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pocket Pro Pet Trimmer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CLP-9931 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone scrub</td>
			<td>PDI</td>
			<td></td>
			<td>S48050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml</td>
			<td>FE1306G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>disposable scalpel</td>
			<td>No. 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heating pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>Model # 1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1749T14</td>
			<td>LH-36233780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Towel drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors and forceps</td>
			<td>FST and Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>4-0 or 5-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool to make the Guide cannular</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Rotary tool (Dremel)</td>
			<td>14H446 (Mfr: EZ456)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter, Pk5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock cut off Wheel</td>
			<td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td>
			<td>1.5&#8221;, Pk2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grinding Wheel, Aluminum Oxide</td>
			<td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock Mandrel</td>
			<td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diamond wheel floor Tile</td>
			<td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosing catheter system</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-GCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Catheters</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-INC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-STY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system

Blod hjerne barrieren (BBB) er et viktig forsvar mot inngangen til potensielt giftige eller patogene stoffer fra blodet inn i sentralnervesystemet (CNS). Men, dens eksistens også dramatisk senker tilgjengeligheten av systemisk administreres terapeutiske midler til CNS. En metode for å overvinne dette, er å injisere disse agentene direkte inn i spinalvæsken (CSF), og dermed omgåelsen BBB. Dette kan gjøres via implantation av et kateter for enten kontinuerlig infusjon ved hjelp av en osmotisk pumpe, eller for enkel bolus levering. I denne artikkelen beskriver vi en kirurgisk protokoll for levering av CNS-målretting antisens oligonukleotider (ASOs) via et kateter implantert direkte inn i cauda equina plass av voksen rotte ryggraden. Som representative resultater, viser vi effekten av en enkelt bolus ASO intratekal (IT) injeksjon via dette catheterization systemet i å slå ned målet RNA i ulike regioner av rotte CNS. Prosedyren er trygg, effektiv og krever ikke dyrt utstyr eller kirurgiske verktøy. Teknikken er beskrevet her kan tilpasses til å levere narkotika i andre modaliteter også.

Ved hjelp av metoden som er beskrevet her, injisert vi to grupper av voksne hunnrotter (250 − 300 g; n = 10/Group) med enten en enkelt bolus av fosfat-bufret saltvann PBS eller 300 μg av ASO rettet mot den lange ikke-koding (LINC) RNA Malat1; i laboratoriet vårt bruker vi rutinemessig Malat1 ASO som et verktøy sammensatt, fordi Malat1 uttrykkes overalt og på høyt nivå i alle vev14, inkludert hjernen og ryggmargen. Malat1 ASO fungerer via en RNaseH1-mediert ...

Watch this Scientific Journal Video about Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System at JoVE.com

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Her beskriver vi en metode for å levere narkotika til rotte sentralnervesystemet ved å implanting et kateter inn i korsryggen intratekal plass i ryggraden. Vi fokuserer på levering av antisens oligonukleotider, men denne metoden er egnet for levering av andre terapeutiske modaliteter også.

Intratekal levering av Antisens Oligonukleotider i Rat Central nervesystemet

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Denne protokollen gjør det mulig for direkte levering av terapeutiske midler inn i rottens sentralnervesystem å evaluere farmakokinetikken, farmakodynamikken og effekten av nye terapeutiske midler i rottesykdomsmodeller. Denne prosedyren er trygg, effektiv og krever ikke dyrt utstyr eller kirurgiske verktøy. Viser prosedyren vil være Yi Chen og Yi Luo, forskere fra laboratoriet mitt.For å forberede de spesielle føringskanylene, bruk et roterende verktøy med et avskåret hjul for å kutte av begge ender av en 19 gauge nål for å oppnå en omtrent en og en halv til to centimeter lang føringskanyle. Bruk deretter slipehjulet på dreieverktøyet til å glatte begge ender. For å forberede katetertrådenheten, kutt ett åtte centimeter langt stykke 011 tommers diameter PE10-rør for å tjene som intratekalkateter for hvert dyr.Bruk en etanolbestandig markørpenn til å lage et merke to centimeter fra den ene enden av hvert stykke rør. For hvert dyr, sett inn en 11 centimeter lang stiltråd kuttet fra polytetrafluoretylenbelagt rustfritt ståltråd i lumen av det åtte centimeter lange PE10-kateteret. For å klargjøre leveringkateterenheten, kutt et stykke på fem til 10 centimeter 023 tommers diameter PE50 kateter og sett inn en 23 gauge røradapter i den ene enden av kateteret.Sett deretter inn en 30 gauge nål med en hub kuttet av i en ca 0,5 centimeter stykke PE10 rør og koble PE10 slangen til den andre enden av kateteret. For å forberede en føring kanyle-nål montering, plasser en føring kanyle over enden av en 23 gauge nål. Før operasjonen begynner, plasser en varmepute på operasjonsbordet og dekk puten med et sterilt drapark.Plasser et konisk sentrifugrør på arket og bekreft mangel på respons på tåklemmen i den bedøvede eksperimentelle rotten. Etter å ha veid dyret, barber ryggen fra halen til den kaudale thorax ryggraden og plasser den barberte rotten på det sterile arket i utsatt stilling. Plasser 50ml-røret under magen for å bøye ryggraden i lumbalområdet, og påfør oftalmisk salve på øynene.Deretter injiserer subkutant ett mg per kilo vedvarende frigjøring Buprenorfin og rengjør den eksponerte huden med sekvensiell povidon og alkoholskrubb. Draper dyret med et fenestrated sterilt gjennomsiktig ark. For plassering av kateteret og injeksjonen av forbindelsen, identifiser de to naturlige gropene mellom musklene over det barberte bekkenet, og med den ene hånden som holder gropene, bruk den andre hånden til å forsiktig trykke og føle ryggraden fra caudal til rostral retning for å finne den første store innrykken mellom ryggvirvlene.Etter å ha identifisert mellomvirvelrommet mellom S1 og L6 ryggvirvler, beveger du deg litt rostrally for å identifisere intervertebralrommet mellom L5 og L6 ryggvirvler. Bruk en skalpell for å gjøre et ikke mer enn to centimeter langt snitt i hud og muskelkapsel på dette stedet langs midtlinjen fra rostral til caudal retning slik at injeksjonsstedet vil være i sentrum av snittet. Bruk disseksjonsaks til å dissekere bort bindevevet til muskellaget kan visualiseres.Lag en centimeter snitt i muskelkapselen umiddelbart lateral til ryggradsprosessen i L6 lumbale vertebra. Plasser førerkanylenålens enhet nær det fremre aspektet av den sjette lumbale vertebraen og skyv forsamlingen inn i det intervertebrale rommet langs det fremre aspektet av den sjette vertebraen slik at enden av nålen trenger inn i spinalkanalen. Bruk sløve tang for å lokalisere ryggradsprosessen til L6 lumbale vertebra og skyv nålen langs det fremre aspektet av den sjette vertebraen inn i det virvelløse rommet.Skyv føringskanylen på plass langs nålen, fjern nålen og sett katetertrådenheten inn i føringskanylen. Fiske kateteret i en ca 45 graders vinkel til spinalkanalen, tvinge enden av kateteret ca 0,3 centimeter inn i kanalen. Fjern stiltråden ca. 2,5 centimeter fra det intratekale spissen av kateteret og før kateteret inn i spinalkanalen til de to centimeter-merkingen på kateteret er like synlig under muskelen.Når kateteret er på plass, fjerner du føringsrammen for å la kateteret og stiltråden være på plass. Før kateteret inn i spinalkanalen til to centimeter merket er ved inngangen til kanalen og helt trekke stiltråden. Cerebral spinalvæske kan visualiseres inn i det implanterte kateteret.Koble deretter leveringskateterenheten til den distale enden av det implanterte kateteret via kanyleenden på 30 gauge. Deretter legger du 60 mikroliter steril saltvann i en 100 mikrolitersprøyte og laster en bolus på 30 mikroliter av testforbindelsen i en annen sprøyte. Koble saltvannssprøyten til røradapteren på leveringskateterenheten og skyll 20 mikroliter steril saltvann inn i det intratekale rommet.Når hele saltvannet er spylt, skift ut saltvannssprøyten med boluslastet sprøyte og injiser 30 mikroliter av testforbindelsen i det intratekale rommet over en periode på 30 sekunder. Når hele bolusen er levert, skift boluslastet sprøyte med en annen saltvannslastet sprøyte og skyll kateteret med ytterligere 40 mikroliter saltvann. Når det andre volumet av saltvann er levert, løsner du leveringskateterenheten fra det implanterte kateteret og bruker et par svært varmesteriliserte disseksjonstang for å klemme ned på slangen for å skjære aseptisk og varmeforsegling av det implanterte kateteret.Bruk absorberbare monofilamentsuger for å feste det varmeforseglede kateteret til bindevevet og bruk deretter ikke-absorberbare suturer for å lukke huden. Bruk deretter gasbind og saltvann til å vaske blod fra huden og plassere rotten i en oppvarmet inkubator med overvåking til full recompency. I dette representative eksperimentet ble veldig god knockdown oppnådd i alle regionene samlet etter enkelt bolus antisense oligonucleotide levering som demonstrert.En viss grad av regional variasjon ble imidlertid målt med ryggmargen som viste den høyeste prosentandelen av knockdown. Etter en vellykket injeksjon av antisense oligonukleotid, eller andre terapeutiske midler, i en passende modell, kan man evaluere farmakokinetikken, farmakodynamikken og effekten av terapeutiske midler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunhistokjemisk analyse i Rat sentralnervesystemet og perifer lymfeknute vevsdelene

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...