Name: intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00
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Nos gustaría dar las gracias a Ionis Pharmaceuticals por suministrar las ASOs descritas en el artículo.

Todos los procedimientos in vivo se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC, por sus cuales) del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC, por sus cuales) siguen las directrices establecidas por la guía de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Preparación de materiales e instrumentos
<ol><li>Prepare las cánulas de guía especiales.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li><li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier:+CNS+delivery+of+small+molecules.">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).</li><li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+barriers+in+health+and+disease.">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li><li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier:+an+overview:+structure,+regulation,+and+clinical+implications.">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li><li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+the+blood-brain+barrier:+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches.">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li><li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier.">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li><li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation.">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).</li><li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor.">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions.">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li><li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides.">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li><li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple,+rapid,+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat.">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li><li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery.">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).</li><li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice.">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li><li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Malat1:+Its+physiological+and+pathophysiological+functions.">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li><li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Targeted+Therapeutics.">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li><li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system.">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).</li><li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models.">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li><li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+Oligonucleotides:+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases.">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li><li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington's+Disease.">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders.">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li><li>Hach&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy:+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience.">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li><li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy.">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li><li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li></ol>

El presente artículo muestra un método potente para administrar agentes terapéuticos directamente en el SNC de rata. En teoría, una técnica similar también se puede realizar en ratones, aunque debido al tamaño más pequeño, el método puede ser más difícil. Por lo tanto, nuestro grupo realiza inyecciones intracerebroventriculares (ICV) en ratones para la administración de fármacos del SNC, que alcanzan los mismos objetivos a través de una vía diferente de administración. Este método se ha descrito en otro...

El sistema vascular del sistema nervioso central (SNC) ha evolucionado como un regulador crítico de la homeostasis, controlando el tráfico de moléculas, suministrando nutrientes y eliminando los residuos. Este sistema es también la primera línea de defensa de los ataques de patógenos externos, gracias a una densa distribución de uniones estrechas a lo largo de las paredes de las células endoteliales. Estas uniones estrechas conforman un aspecto de la barrera hematoencefálica (BBB). Mientras que el BBB permite el transporte de moléculas necesarias para satisfacer las demandas de nutrientes y energía (por ejemplo, iones, glucosa), también limita selectivamente el paso de patógenos, así como sustancias químicas tóxicas1,2,3.
Irónicamente, la misma función protectora del BBB que limita el paso de patógenos y sustancias químicas tóxicas también es el principal obstáculo para nuestra capacidad de acceder fácilmente al SNC con tratamientos terapéuticos después de la administración sistémica al organismo2, 4,5. Este papel del BBB ha impulsado el desarrollo de una plétora de nuevas tecnologías y enfoques de distribución de medicamentos6.
Una forma de superar este obstáculo es inyectar los fármacos directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) que persigue continuamente tanto el cerebro como la médula espinal7,8,9,10. En este artículo, describimos un método para entregar con éxito agentes en el espacio intratecal lumbar colocando el extremo interno del catéter completamente en el espacio de la quinquina cauda de la columna vertebral de la rata. Mazur et al. en otros lugares11publicaron previamente una descripción de este procedimiento.
El protocolo es muy eficaz y produce una tasa de éxito superior al 90% de la entrega de oligonucleótidos antisentido (ASO) al SNC cuando se evalúa mediante un análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) del desenlace del gen objetivo8. El procedimiento causa un mínimo de malestar a los animales, ya que el 100% de las ratas sobreviven a la cirugía y muestran una hinchazón mínima alrededor de la herida quirúrgica y no hay signos de angustia (por ejemplo, hiperactividad, deshidratación, círculos, pérdida de equilibrio, disminución de la ingesta de alimentos y deshidratación) durante la observación postoperatoria. Otra ventaja del método descrito aquí es que no requiere equipos caros, ni herramientas especiales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc</td>
			<td></td>
			<td>8416-160Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab sticks</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>NO 1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip</a></td>
			<td>BD</td>
			<td>1ml TB Luer-Lok tip</td>
			<td>BD 302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in</td>
			<td>BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
			<td>BD</td>
			<td>Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in</td>
			<td>BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Intramedic PE Tubing Adapters</td>
			<td>BD</td>
			<td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td>
			<td>BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E</td>
			<td>120V 1.2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>BD 305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Sustained Release-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Prescription required</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene oxide sterilizer</td>
			<td>Andersen Sterilizer INC.</td>
			<td>AN 74i, gas sterilizer</td>
			<td>AN 74i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>BD</td>
			<td>19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle</td>
			<td>BD 305186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>Hamilton syringe 100ul</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>STERILIZER MODELNO FST 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Dechra veterranery product</td>
			<td></td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pocket Pro Pet Trimmer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CLP-9931 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone scrub</td>
			<td>PDI</td>
			<td></td>
			<td>S48050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml</td>
			<td>FE1306G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>disposable scalpel</td>
			<td>No. 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heating pad</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td></td>
			<td>Model # 1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>1749T14</td>
			<td>LH-36233780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Towel drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td></td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors and forceps</td>
			<td>FST and Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>4-0 or 5-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool to make the Guide cannular</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Rotary tool (Dremel)</td>
			<td>14H446 (Mfr: EZ456)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter, Pk5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock cut off Wheel</td>
			<td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td>
			<td>1.5&#8221;, Pk2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grinding Wheel, Aluminum Oxide</td>
			<td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EZ lock Mandrel</td>
			<td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td>
			<td>1.5&#8221; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diamond wheel floor Tile</td>
			<td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosing catheter system</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-GCA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Catheters</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-INC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stylet Wire</td>
			<td>SAI Infusion Systems</td>
			<td></td>
			<td>RIDC-STY</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system

La barrera hematoencefálica (BBB) es una defensa importante contra la entrada de agentes potencialmente tóxicos o patógenos de la sangre en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, su existencia también reduce drásticamente la accesibilidad de los agentes terapéuticos administrados sistémicamente al SNC. Un método para superar esto, es inyectar esos agentes directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR), evitando así el BBB. Esto se puede hacer a través de la implantación de un catéter para perfusión continua utilizando una bomba osmótica, o para la administración de bolo único. En este artículo, describimos un protocolo quirúrgico para la entrega de oligonucleótidos antisentidos dirigidos al SNC (ASO) a través de un catéter implantado directamente en el espacio de cauda equina de la columna adulta de rata. Como resultados representativos, mostramos la eficacia de una única inyección intratecal de ASO de bolo a través de este sistema de cateterismo para derribar el ARN objetivo en diferentes regiones del SNC de rata. El procedimiento es seguro, eficaz y no requiere costosos equipos o herramientas quirúrgicas. La técnica descrita aquí también se puede adaptar para suministrar medicamentos en otras modalidades.

Usando el método descrito aquí, inyectamos dos grupos de ratas hembra adultas (250-300 g; n a 10/grupo) con un solo bolo de PBS salino con búfer de fosfato o 300 g de ASO dirigidos al ARN Malat1 largo no codificante (linc); en nuestro laboratorio utilizamos rutinariamente el Malat1 ASO como un compuesto de herramienta, porque Malat1 se expresa ubicuamente y a niveles altos en todos los tejidos14,incluyendo el cerebro y la médula espinal. El Malat1 ASO funciona ...

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Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.

Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Este protocolo permite la entrega directa de terapias en el sistema nervioso central de la rata para evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de nuevas terapias en modelos de enfermedad de rata. Este procedimiento es seguro, eficaz y no requiere equipos costosos ni herramientas quirúrgicas. Demostrando el procedimiento serán Yi Chen y Yi Luo, científicos de investigación de mi laboratorio.Para preparar las cánulas guía especiales, utilice una herramienta giratoria con una rueda cortada para cortar ambos extremos de una aguja de calibre 19 para obtener una cánula guía de aproximadamente un centímetro y medio a dos centímetros de largo. A continuación, utilice la rueda de rectificación de la herramienta giratoria para suavizar ambos extremos. Para preparar el conjunto de alambre del catéter, corte una pieza de ocho centímetros de largo de tubo PE10 de 011 pulgadas de diámetro para servir como el catéter intratecal para cada animal.Utilice un rotulador resistente al etanol para hacer una marca a dos centímetros de un extremo de cada pieza de tubo. Para cada animal, inserte un alambre de estilo de 11 centímetros de largo cortado de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno en el lumen del catéter PE10 de ocho centímetros de largo. Para preparar el conjunto del catéter de entrega, corte una pieza de cinco a 10 centímetros 023 pulgadas de diámetro de catéter PE50 e inserte un adaptador de tubo de calibre 23 en un extremo del catéter.A continuación, inserte una aguja de calibre 30 con un cubo cortado en una pieza de aproximadamente 0,5 centímetros de tubo PE10 y conecte el tubo PE10 al otro extremo del catéter. Para preparar un conjunto guía de cánula-aguja, coloque una cánula guía sobre el extremo de una aguja de calibre 23. Antes de comenzar la cirugía, coloque una almohadilla de calentamiento en la mesa de la cirugía y cubra la almohadilla con una sábana de cortina estéril.Coloque un tubo de centrífuga cónica de 50 ml en la lámina y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en la rata experimental anestesiada. Después de pesar al animal, afeitar la espalda de la cola a la columna torácica caudal y colocar la rata afeitada en la hoja estéril en la posición propensa. Coloque el tubo de 50 ml debajo del abdomen para flexionar la columna vertebral en la región lumbar y aplique pomada oftálmica a los ojos.A continuación, inyectar por vía subcutánea un miligramo por kilogramo de buprenorfina de liberación sostenida y limpiar la piel expuesta con povidona secuencial y exfoliaciones de alcohol. Escurre al animal con una lámina transparente estéril fenestrada. Para la colocación del catéter y la inyección del compuesto, identifique los dos hoyos naturales entre los músculos por encima de la pelvis afeitada, y con una mano sosteniendo los hoyos, utilice la otra mano para presionar suavemente y sentir la columna vertebral desde la dirección caudal a rostral para localizar la primera sangría mayor entre las vértebras.Después de identificar el espacio intervertebral entre las vértebras S1 y L6, muévase ligeramente rostralmente para identificar el espacio intervertebral entre las vértebras L5 y L6. Utilice un bisturí para hacer una incisión de no más de dos centímetros de largo en la piel y la cápsula muscular en este sitio a lo largo de la línea media de la dirección rostral a caudal para que el lugar de inyección esté en el centro de la incisión. Utilice tijeras de disección para diseccionar el tejido conectivo hasta que se pueda visualizar la capa muscular.Haga una incisión de un centímetro en la cápsula muscular inmediatamente lateral al proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6. Coloque el conjunto de aguja de la cánula guía cerca del aspecto anterior de la sexta vértebra lumbar y empuje el ensamblaje hacia el espacio intervertebral a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra para que el extremo de la aguja penetre en el canal espinal. Utilice fórceps contundentes para localizar el proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6 y luego empuje la aguja a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra en el espacio invertebrata.Empuje la cánula guía en su lugar a lo largo de la aguja, retire la aguja e inserte el conjunto del alambre del catéter en la cánula guía. Angling el catéter en un ángulo de aproximadamente 45 grados al canal espinal, forzar el extremo del catéter aproximadamente 0,3 centímetros en el canal. Retire el alambre de estilo aproximadamente 2,5 centímetros de la punta intratecal del catéter y avance el catéter hacia el canal espinal hasta que el marcado de dos centímetros en el catéter sea simplemente visible debajo del músculo.Cuando el catéter esté en su lugar, retire la cánula guía para dejar el catéter y el alambre de estilo en su lugar. Avance el catéter en el canal espinal hasta que la marca de dos centímetros esté en la entrada del canal y retire completamente el cable de estilo. El líquido cefalorraquídeo se puede visualizar entrando en el catéter implantado.A continuación, conecte el conjunto del catéter de entrega al extremo distal del catéter implantado a través del extremo de la aguja del calibre 30. A continuación, cargue 60 microlitros de solución salina estéril en una jeringa de 100 microlitros y cargue un bolo de 30 microlitros del compuesto de prueba en una segunda jeringa. Conecte la jeringa salina al extremo del adaptador de tubería del conjunto del catéter de entrega y enjuague 20 microlitros de solución salina estéril en el espacio intratecal.Cuando se haya lavado toda la solución salina, sustituya la jeringa salina por la jeringa cargada en bolo e inyecte 30 microlitros del compuesto de ensayo en el espacio intratecal durante un período de 30 segundos. Cuando se haya entregado todo el bolo, sustituya la jeringa cargada de bolo por otra jeringa cargada con solución salina y enjuague el catéter con 40 microlitros adicionales de solución salina. Cuando se haya entregado el segundo volumen de solución salina, desprenda el conjunto del catéter de entrega del catéter implantado y utilice un par de fórceps de disección esterilizados con calor muy caliente para sujetar el tubo para cortar y sellar térmicamente el catéter implantado.Utilice suturas monofilamento absorbibles para fijar el catéter termosellado al tejido conectivo y luego utilice suturas no absorbibles para cerrar la piel. Luego use gasas y solución salina para lavar cualquier sangre de la piel y coloque la rata en una incubadora calentada con monitoreo hasta la plena recomprensión. En este experimento representativo, se obtuvo un muy buen derribo en todas las regiones recolectadas después de un solo parto de oligonucleótido de bolo antisenfoto como se demostró.Sin embargo, se midió cierto grado de variabilidad regional con la médula espinal que presenta el mayor porcentaje de derribo. Después de una inyección exitosa del oligonucleótido antisenso, u otras terapias, en un modelo adecuado, se puede evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de las terapias.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Medicamentos sistémicos y locales de entrega para el Tratamiento de Enfermedades del Sistema Nervioso Central en modelos de roedores

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Investigación

Neurociencias

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

La transección del nervio óptico: un modelo de apoptosis neuronal de adultos en el sistema nervioso central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...