Name: high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00
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Wir danken Daniel May, Marc Chevrette und Don Hoang für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit, einschließlich der Bemühungen von Cameron R. Currie, wurde von der University of Wisconsin-Madison, Office of the Vice Chancellor for Research and Graduate Education, mit Mitteln der Wisconsin Alumni Research Foundation unterstützt. National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck wurde von einem Ausbildungsstipendium der National Library of Medicine für das Computation and Informatics in Biology and Medicine Training Program (NLM 5T15LM007359) unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -interpretation oder bei der Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einzureichen.

Die Eltern des Spenders erhielten die Zustimmung, und das Human Subjects Committee der University of Wisconsin-Madison genehmigte die Studie (Institutional Review Board [IRB] Zulassungsnummer H-2013-1044).
1. Beispielkultur
HINWEIS: Dieses Verfahren wird hier für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Bakterienisolaten aus der menschlichen Nasenhöhle verwendet. Grundsätzlich gelten die folgenden Methoden für jede Kulturbedingung. Gehirn-He...

<ol>
	<li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Communities:+Interactions+to+Scale.">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).</li><li>Green, J., Bohannan, B. J. 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C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry,+Metabolism,+and+New+Views+of+the+Microbial+World.">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li><li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry.">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li><li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota.">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li><li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophore-mediated+transport.">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li><li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes.">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).</li></ol>

Antibiotika und andere sekundäre Metaboliten, die mikrobielle Wechselwirkungen vermitteln, sind für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich der Entdeckung von Arzneimitteln. Hierin wird ein Protokoll für Co-Kultur-Assays zur Bewertung einer großen Anzahl von mikrobiellen Wechselwirkungen vorgestellt. Diese Co-Kultur-Interaktions-Assays sind ein einfaches, erschwingliches, skalierbares und hohes Durchsatzmittel, um viele paarweise Kombinationen von Mikroorganismen im Tandem zu untersuchen. Zielorganis...

In der Natur existieren Mikroorganismen selten isoliert; folglich interagieren sie ständig mit anderen Organismen. Daher ist es wichtig, zu untersuchen, wie Mikroorganismen miteinander interagieren, um eine Vielzahl von mikrobiellen Verhaltensweisen zu verstehen1. Mikrobielle Wechselwirkungen können gegenseitigkeits-, kominsiver oder antagonistischer sein. Diese In-teractions können nicht nur die Mikroorganismen selbst beeinflussen, sondern auch die Umgebungen und Wirte, die die Mikroorganismen besiedeln1,2.
Viele Wissenschaftler untersuchen mikrobielle Wechselwirkungen, um neue antimikrobielle Moleküle zu identifizieren. Eines der ersten klinisch wichtigen antimikrobiellen Moleküle wurde durch die Untersuchung von mikrobiellen Wechselwirkungen gefunden. Sir Alexander Fleming beobachtete ein kontaminierendes Penicillium spp. Isolat, das das Wachstum eines Staphylococcus-Stamms hemmte, was zur Entdeckung des häufig verwendeten Antibiotikums Penicillin3führte. Die Charakterisierung der Mechanismen, die Mikroorganismen verwenden, um ihre Konkurrenten zu verärgern, bleibt eine fruchtbare Ressource für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass Streptomyces sp. Stamm Mg1 antibiotische Linearmycine produziert, die eine lytische und abbauende Wirkung gegen Bacillus subtilis4haben.
Darüber hinaus wurde kürzlich ein nicht-ribosomal synthetisiertes Peptid namens Lugdunin entdeckt, nachdem festgestellt wurde, dass der nasale Commensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureus5hemmt. Studien haben auch gezeigt, dass mutualistische Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen ebenso stark sind wie antagonistische Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle. Zum Beispiel beherbergen viele pilzbewirtschaftende Ameisen im Stamm Attini symbiotische Bakterien namens Pseudonokardie auf ihrem Exoskelett, das antimykotische Moleküle produziert, um einen obligaten Erreger ihrer Pilzernte zu hemmen6. Da die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen für die Entdeckung antimikrobieller Moleküle von Vorteil war, kann die Verwendung von Bildschirmen mit hohem Durchsatz zur Entdeckung neuer antimikrobieller Moleküle führen.
In Bezug auf die Kosten und die Leichtigkeit der Leistung reichen die Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen von einfach bis komplex. Zum Beispiel ist ein Agar-Plug-Assay eine kostengünstige und einfache Methode, die verwendet werden kann, um Antagonismus zwischen mehreren Mikroorganismen zu untersuchen7. Ein Agar-Plug-Assay ist jedoch kein effizientes Verfahren und kann für viele paarweise Kombinationen arbeitsintensiv sein. Um die Auswirkungen mikrobiell hergestellter Produkte auf Zielisolate mit hohem Durchsatz zu bewerten, verwenden viele Laboratorien Plattendiffusionstests8. Diese Assays sind einfach und kostengünstig und können auf eine höhere Anzahl von Probenskalierbarsein 7 . Dieser Test erfordert jedoch die Erzeugung von mikrobiellen Extrakten und kann irreführende Ergebnisse für bestimmte Kombinationen von Zielorganismen und Antibiotika wie Salmonellen und Cephalosporinen9produzieren.
Die vorhergehenden Ansätze basieren auf isolierten Komponenten, um eine Reaktion in einem Zielorganismus auszulösen, anstatt Mikroorganismen die Interaktion miteinander zu ermöglichen. Dies ist bemerkenswert, da Wechselwirkungen zwischen Mikroben die Produktion von "kryptischen" antimikrobiellen Molekülen auslösen können, die nicht in monokultural produziert werden. So wurde kürzlich gezeigt, dass das antimikrobielle Keyicin nur von einem Micromonospora sp. produziert wird, wenn es mit einem Rhodococcus sp. kokultiviert wird, der aus dem gleichen Schwammmikrobiom10isoliert ist. Komplexere Interaktionsmethoden umgehen dieses potenzielle Monokulturhindernis. Zum Beispiel ist der iChip nützlich für die Isolierung seltener und schwer zu kultivierender Bakterien aus Umweltproben und ermöglicht die Beobachtung mikrobieller Wechselwirkungen durch Wachstum in situ11. Um Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, kann eine matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-of-Flight-Bildgebungs-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-IMS) verwendet werden. Dieser Ansatz liefert detaillierte Informationen über die Zusammensetzung und Verteilung von kleinen Molekülen und Peptiden, die durch interagierende mikrobielle Kolonien mit hoher räumlicher Auflösung erzeugt werden. MALDI-TOF-IMS wurde auch in mehreren Studien von bakteriellen Wechselwirkungen verwendet, um die Mechanismen des Wettbewerbs12,13,14,15zu charakterisieren. MALDI-TOF-IMS erfordert jedoch oft eine aufwendige Probenvorbereitung, spezielles Know-how für den Betrieb der Geräte sowie teure und spezialisierte Massenspektrometer. Aus diesen Gründen ist es eine schwierige Technik für Studien mit hohem Durchsatz zu verwenden. Daher wäre ein einfacher, skalierbarer und hoher Durchsatz-Co-Kultur-Assay für mikrobielle Wechselwirkungen, der viele Einschränkungen der oben genannten Ansätze überwindet, von Vorteil.
Hier wird ein Protokoll für die mikrobielle Kokultur mit hohem Durchsatz vorgestellt. Dieser Test ist einfach und leicht in bereits bestehende Studien über mikrobielle Wechselwirkungen integriert. Im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Methoden zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist unsere Methode einfach, kostengünstig und kann eine große Anzahl von Wechselwirkungen untersuchen. Diese Assays sind nicht nur einfach durchzuführen, sondern die Materialien sind bei den meisten Laborlieferanten oder öffentlichen Ressourcen (z. B. Bibliotheken und Makerspaces) weit verbreitet. Folglich ist dieser Test als erste Untersuchungslinie vorteilhaft, um interessante Muster unter vielen paarweisen Kombinationen von Mikroorganismen zu identifizieren und zu analysieren, was besonders für die Untersuchung der mikrobiellen Ökologie nützlich sein kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, yellow</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, sterile with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, bacteriological</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSB11000-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filament, white, 3mm diameter</td>
			<td>Keene Village Plastics</td>
			<td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>School Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td>EPIE304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taz 6 3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions

Die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen hat zu zahlreichen Entdeckungen geführt, von neuartigen antimikrobiellen Mitteln bis hin zu Erkenntnissen in der mikrobiellen Ökologie. Viele Ansätze, die für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen verwendet werden, erfordern spezielle Ausrüstung und sind teuer und zeitintensiv. Dieses Dokument stellt ein Protokoll für Co-Kultur-Interaktionstests vor, die kostengünstig, skalierbar auf große Stichprobennummern sind und sich leicht an zahlreiche experimentelle Designs anpassen lassen. Mikroorganismen werden zusammen kultiviert, wobei jeder Brunnen eine paarweise Kombination von Mikroorganismen darstellt. Ein Testorganismus wird auf einer Seite jedes Brunnens kultiviert und zuerst in Monokultur inkubiert. Anschließend werden Zielorganismen gleichzeitig mit einem 3D-gedruckten Impfstempel auf die gegenüberliegende Seite jedes Brunnens geimpft. Nach der Co-Kultur werden die abgeschlossenen Assays für visuelle Phänotypen wie Wachstum oder Hemmung bewertet. Diese Assays können verwendet werden, um Phänotypen zu bestätigen oder Muster unter Isolaten von Interesse zu identifizieren. Mit dieser einfachen und effektiven Methode können Anwender Kombinationen von Mikroorganismen schnell und effizient analysieren. Dieser Co-Kultur-Ansatz gilt sowohl für die Entdeckung von Antibiotika als auch für die kulturbasierte Mikrobiomforschung und wurde bereits erfolgreich auf beide Anwendungen angewendet.

Co-Kultur-Interaktions-Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen zu verstehen, Interessenmuster zu identifizieren und mikrobielle Isolate mit faszinierenden Aktivitäten aufzudecken. In diesen Tests wird ein Testorganismus auf einer Seite einer 12 Well-Agar-Platte monokultiviert und für 7 Tage inkubiert. Anschließend wird ein Zielorganismus neben dem Testorganismus gesichtet und die beiden Mikroben wurden 7 Tage lang gemeinsam kultiviert, bevor sie den Wachstumsph...

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High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Die in diesem Protokoll vorgestellten Co-Kultur-Interaktions-Assays sind kostengünstig, hochdurchstöbet und einfach. Diese Assays können verwendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in der Kokultur zu beobachten, Interaktionsmuster zu identifizieren und das hemmende Potenzial eines mikrobiellen Stammes von Interesse gegen menschliche und ökologische Krankheitserreger zu charakterisieren.

High Throughput Co-Culture Assays für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Unser Protokoll bietet eine Methode mit hohem Durchsatz zum Screening einer großen Anzahl paarweiser mikrobiellen Wechselwirkungen im Tandem, um Wechselwirkungen von Interesse zu identifizieren, die mikrobiomische Forschung und antimikrobielle Entdeckung unterstützen können. Diese Methode ist leicht anwendbar für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Systemen, solange die Mikroorganismen unter Laborbedingungen kulturfähig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Benutzern ermöglicht, eine große Anzahl von mikrobiellen Wechselwirkungen in relativ kurzer Zeit zu überprüfen.Neue Anwender dieser Technik sollten sich Zeit nehmen, insbesondere bei der Impfung der Bioassayplatten, da es wichtig ist, vorsichtig zu sein, über wachsenoder Kontamination zu minimieren. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Impfung der Bioassayplatten Präzision erfordert, um sicherzustellen, dass die Organismen die Brunnen nicht überwuchern und die Kokulturen nicht kontaminiert sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Nachtkulturen.Verwenden Sie eine serologische Pipette, um drei Milliliter BHI-Brühe in 14-Milliliter-Kulturröhren hinzuzufügen. Verwenden Sie dann eine sterile einMikroliter-Impfschleife, um eine Bakterienkolonie in die Brühe zu impfen. Wirbeln Sie die Schleife, um sicherzustellen, dass sich der Klumpen in die Brühe verteilt.Kurz wirbeln die Kulturröhren, und bebrüten sie über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 250 U/min. Sobald die Bakterienkulturen eine OD 600 über eins erreichen, wirbeln sie, um die Klumpen von Zellen aufzubrechen. Bereiten Sie PHI-Medien mit 1,5% Agar vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.Dann kühlen Sie die Medien in einem temperaturgeregelten Wasserbad auf 55 Grad Celsius ab und geben Sie drei Milliliter geschmolzener BHI-Medien in jeden der 12 Brunnen auf einer Platte aus, damit die Brunnen so gleichmäßig wie möglich sind. Dann lassen Sie den Agar über Nacht setzen. Impfen Sie den Testorganismus auf einer Bioassayplatte, indem Sie eine sterile 10-Mikroliter-Impfschleife in die Nachtkultur einfügen und das Kulturtröpfchen über das linke Drittel eines Plattenbrunnens streifen.Wiederholen Sie dies, bis alle 12 Bohrungen auf der Platte geimpft wurden. Inkubieren Sie die Platten sieben Tage lang bei entsprechender Temperatur auf den Kopf. Wenn Sie bei Temperaturen von mehr als oder gleich 37 Grad Celsius oder in trockeneren Klimazonen brüten, lagern Sie die Platten in einem feuchten Behälter, um zu verhindern, dass sie austrocknen.Nach der sechstägigen Inkubation der Bioassayplatte, bereiten Sie über Nacht Kulturen des Zielorganismus wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie die Zielplatte vor, indem Sie jeden Brunnen einer leeren 12-Well-Platte mit 1,8 Milliliter NHI und 200 Mikrolitern der Ziel-Übernachtungskultur füllen. Legen Sie einen sterilen Impfstempel in die Zielplatte.Wirbeln Sie die Kulturen sanft um die Brunnen und sorgen Sie dafür, dass sie benachbarte Brunnen nicht verunreinigen. Heben Sie den Impfstempel an, und stellen Sie sicher, dass sich auf jeder Stempelspitze ein Tröpfchen verdünnter Zielkultur befindet. Legen Sie den Impfstempel auf eine uninokulierte Bioassay-Platte und schaukeln Sie den Stempel sanft, so dass das Kulturtröpfchen jeden Brunnen impft.Sobald der Stempel entfernt ist, sollte ein Tröpfchen Kultur in den Brunnen sichtbar sein. Wenn keine Brunnen nicht mit dem Impfstempel geimpft werden, erkennen Sie mit einer Pipette drei Mikroliter verdünnter Nachtkultur auf die Brunnen. Dann impfen Sie die Bioassay-Platten wie zuvor beschrieben, richten Sie aber die Stempelspitzen an der rechten Seite der 12-Well-Platte aus, um sicherzustellen, dass die Marke nicht mit der bestehenden Bakterienkolonie in Berührung kommt.Entfernen Sie den Stempel vorsichtig und legen Sie ihn wieder in die Zielplatte. Wenn sich der Agar in den Brunnen ungleichmäßig verfestigt hat, schaukeln Sie den Stempel sanft hin und her, aber achten Sie darauf, den Stempel nicht in das Wachstum des Testorganismus zu verschieben. Wiederholen Sie die Impfung für jede Bioassayplatte, bis alle Platten geimpft sind, und brüten Sie die Platten dann sieben Tage lang bei der entsprechenden Temperatur auf den Kopf.Nachdem Sie den Test- und Zielorganismus eine Woche lang mitgeprägt haben, bewerten Sie die Wechselwirkungen anhand einer visuellen Bewertung. Bewerten Sie die Brunnen mit dem Zielorganismuswachstum, das ein ununterscheidbares Wachstum von der Monokultur als Null aufweist. Erzielen Sie die Brunnen mit verringertem Wachstum als eins, und kein Wachstum als zwei.Die hier beschriebenen Co-Kultur-Assays wurden verwendet, um die hemmende Aktivität der Actinobacteria-Testorganismen gegenüber den Staphylokokken-Arten als Zielorganismen zu bewerten, die aus der menschlichen Nasenhöhle isoliert sind. Insgesamt wurden 812 paarweise Kombinationen getestet. Insbesondere, Corynebacterium propinquum stark gehemmt Koagulase negative Staphylokokken, vor allem im Vergleich zu anderen Corynebacteria, die entweder schwach gehemmt Koagulase negative Staphylokokken oder hatte keine hemmende Wirkung.Durch den Einsatz vergleichender Genomik wurde im Corynebacterium propinquum Genom ein biosynthetischer Gencluster zur Siderophorproduktion identifiziert. Co-Kultur-Interaktions-Assays mit Standard- und eisenergänztem BHI-Medium stellten fest, dass der Hemmungsphänotyp zwischen Corynebacterium propinquum und coagulase negative Staphylokokken tatsächlich eisenabhängig war. Es ist wichtig, beim Stanzen der Platte vorsichtig zu sein.Überprüfen Sie jeden Brunnen nach dem Stempeln, und stellen Sie sicher, dass der Impfstempel korrekt ausgerichtet ist, um eine Kontamination zu verhindern. Nach der Identifizierung von Wechselwirkungen von Interesse können nachfolgende Studien mit mikrobiellen Genetik und Genomik, natürliche Produktisolation und Charakterisierung oder bildgebende Massenspektrometrie verwendet werden, um Mechanismen zu charakterisieren, die diesen Wechselwirkungen zugrunde liegen. Dieses Protokoll wurde vor kurzem verwendet, um Siderophor-vermittelten Wettbewerb unter der menschlichen Nasenmikrobiota aufzudecken, und half bei der Entdeckung eines neuen antimyktischen Moleküls namens Cyphomycin.

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