Name: high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions at JoVE.com

אנו מודים לדניאל מאי, מארק שירט ודון ואנג על הקריאה הקריטית של כתב היד. עבודה זו, כולל המאמצים של קמרון R. קורי, נתמכת על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, משרד סגן הקנצלר למחקר ובוגר השכלה עם מימון של הקרן למחקר ויסקונסין בוגרים, מימון שסופק גם על ידי ה המכונים הלאומיים למרכזי בריאות למצוינות במחקר טרנסלtional (U19-AI109673-01). ריד מ. סטובננק נתמך על ידי הספרייה הלאומית של מענק הכשרת הרפואה למחשוב ולאינפורמטיקה בתוכנית ההכשרה לביולוגיה ולרפואה (NLM 5T15LM007359). לתורמים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, באיסוף הנתונים ובפרשנות, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.

הסכמה מושכלת הושגה מהוריו של התורם, וועדת האדם באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון אישרה את המחקר (לוח סקירה מוסדי [IRB] אישור מספר H-2013-1044).
1. דוגמא לתרבות
הערה: הליך זה משמש כאן לחקר האינטראקציות בין חיידקים מבודד מחלל האף האנושי. בעיקרון, השיטות הבאות ישימות ?...

<ol>
	<li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Communities:+Interactions+to+Scale.">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).</li><li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity.">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li><li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium,+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz&#230;.">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenz&#230;.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+from+Lethal+Bacterial+Competition+through+Coupled+Activation+of+Antibiotic+Resistance+and+a+Mobilized+Subpopulation.">Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation.</a> PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).</li><li>Zipperer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+commensals+producing+a+novel+antibiotic+impair+pathogen+colonization.">Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization.</a> Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).</li><li>Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites.">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li><li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity:+A+review.">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li><li>Heatley, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+assay+of+penicillin.">A method for the assay of penicillin.</a> The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).</li><li>Adnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+of+Marine+Invertebrate-Associated+Bacteria+and+Interdisciplinary+Technologies+Enable+Biosynthesis+and+Discovery+of+a+New+Antibiotic,+Keyicin.">Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin.</a> ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+iChip+for+high+throughput+in+situ+cultivation+of+&amp;#34;uncultivable&amp;#34;+microbial+species.">Use of iChip for high throughput in situ cultivation of &amp;#34;uncultivable&amp;#34; microbial species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Gonzalez, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+competition+between+Bacillus+subtilis+and+Staphylococcus+aureus+monitored+by+imaging+mass+spectrometry.">Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry.</a> Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).</li><li>Hoefler, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+resistance+to+the+lipopeptide+surfactin+as+identified+through+imaging+mass+spectrometry+of+bacterial+competition.">Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).</li><li>Hoefler, B. C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry,+Metabolism,+and+New+Views+of+the+Microbial+World.">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li><li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry.">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li><li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota.">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li><li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophore-mediated+transport.">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li><li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes.">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).</li></ol>

אנטיביוטיקה ומטבוליטים משניים אחרים הבתווך אינטראקציות מיקרוביאלית שימושיות עבור שפע של יישומים, כולל גילוי סמים. במסמך זה, פרוטוקול לשיתוף התרבות המשותף מציג להערכת מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאלית. אלה שיתוף התרבות ההדדית האינטראקציה היא פשוטה, סבירים, מדרגי, תפוקה גבוהה פירושו לחק?...

בטבע, לעתים נדירות מיקרואורגניזמים קיימים בבידוד; כתוצאה מכך, הם מאינטראקציה ללא הרף עם אורגניזמים אחרים. לכן, לימוד כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים אחד עם השני הוא חיוני כדי להבין ריבוי של התנהגויות חיידקים1. אינטראקציות מיקרוביאלית יכולות להיות מדדיות, מיו, או אנטליסטית. אלה ב teractions יכול להשפיע לא רק את המיקרואורגניזמים עצמם אלא גם את הסביבות והמארחים כי המיקרואורגניזמים ליישב1,2.
מדענים רבים מחקר אינטראקציות מיקרוביאלית כדי לזהות מולקולות מיקרוביאלית חדש. אחד מולקולות קליניות מיקרוביאלית חשוב הראשון נמצא באמצעות המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית. סר אלכסנדר פלמינג הבחין מזהם Penicליום spp. בידוד כי עכבות את הצמיחה של זן סטייהילוקוקוס , אשר הוביל לגילוי של פניצילין אנטיביוטי נפוץ3. אפיון המנגנונים בהם משתמשים מיקרואורגניזמים כדי להרגיז את המתחרים שלהם נותר משאב פורה לגילוי מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, זה הוכח לאחרונה כי Streptomyces sp. מאמץ Mg1 מייצרת linearmycins אנטיביוטי, אשר יש פעילות lytic ו degradative נגד מקרתגו subtilis4.
יתר על כן, פפטיד לא מסונתז בעלי שם לוגדאנב התגלתה לאחרונה לאחר התצפית כי האף המולוקוקוס מעכב אתמחלת הקוקוס המכונה5. מחקרים הראו גם כי אינטראקציות מדדיות בין המיקרואורגניזמים הם באותה מידה חזקה כמו אינטראקציות עוינת לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית. לדוגמה, רבים פטריה-חקלאות נמלים בתוך השבט Attini חיידקים סימביוטי המכונה Pseudonocardia על השלד החיצוני שלהם שמייצר מולקולות פטריות כדי לעכב את הפתוגן מחייב של יבול פטרייתי שלהם6. כמו המחקר של אינטראקציות מיקרוביאלית כבר מועיל לגילוי מולקולות מיקרוביאלית, השימוש במסכים תפוקה גבוהה עלול לגרום לגילוי של מולקולות מיקרוביאלית חדשים.
ביחס לעלות ולקלות הביצועים, המתודולוגיות המשמשות לחקר האינטראקציות של מיקרוביאלית נעות בין פשוטה למורכבת. למשל, שיטת התקע אגר היא שיטה זולה ופשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את האנטניזם בין מיקרואורגניזמים מרובים7. עם זאת, שיטת התקע של אגר אינה הליך יעיל והיא יכולה להיות אינטנסיבית לעבודה עבור שילובים רבים של זיווגים. כדי להעריך את ההשפעות של מוצרים מתוצרת microbially על מבודד היעד של עניין באופן תפוקה גבוהה, מעבדות רבות להשתמש הדיסק דיפוזיה בחני8. שמות אלה הם קלים וזולים יכול להיות מדרגי למספר גבוה יותר של דגימות7. עם זאת, מעשה זה דורש את הדור של תמציות מיקרוביאלית ועשוי לייצר תוצאות מטעה עבור צירופים מסוימים של אורגניזמים ואנטיביוטיקה היעד, כגון סלמונלה ו צפלוספורנס9.
הגישות הקודמות מסתמכות על רכיבים מבודדים כדי לעורר תגובה באורגניזם מטרה, במקום לאפשר למיקרואורגניזמים לקיים אינטראקציה זה עם זה. זה של הערה משום שאינטראקציות בין חיידקים עשוי לעורר את הייצור של מולקולות מיקרוביאלית של "סודי" שאינם מיוצרים בתרבית. למשל, זה הוכח לאחרונה כי keyicin מיקרוביאלית מופק רק על ידי מיקרוונוספורמטר sp. כאשר משותף לתרבות עם מעלה sp. כי הוא מבודד מיקרובידום ספוג אותו10. מתודולוגיות אינטרקציה מורכבות יותר מאפשרות לעקוף את העיכוב הפוטנציאלי בתרבות המונאלית. למשל, ה-iChip שימושי לבידוד נדיר וקשה לטיפוח חיידקים מדגימות סביבתיות ומאפשר התבוננות באינטראקציות מיקרוביאלית באמצעות צמיחה באתרו11. כדי לחקור את האינטראקציות בפרוטרוט, מטריקס סייעה להשתמש בהדמיית לייזר להדמיה בזמן של טיסת הדמיה של המסה ספקטרומטריה (MALDI-תוף-IMS). גישה זו מספקת מידע מפורט על הרכב והפצה של מולקולות קטנות פפטידים המיוצר על ידי אינטראקציה מושבות מיקרוביאלית עם רזולוציה מרחבית גבוהה. Maldi-תוף-IMS שימש גם במחקרים מרובים של אינטראקציות חיידקי כדי לאפיין את מנגנוני התחרות12,13,14,15. עם זאת, MALDI-תוף-IMS לעתים קרובות דורש הכנה לדוגמה מפרך, מומחיות מיוחדת כדי להפעיל את הציוד, ואת יקר ומיוחדות ספקטרומטר מסה. מסיבות אלה, זוהי טכניקה קשה לשימוש עבור לימודי תפוקה גבוהה. לפיכך, שיטת שיתוף תרבות פשוטה, מדרגית ובעלת תפוקה גבוהה עבור אינטראקציות מיקרוביאלית הגוברת על מגבלות רבות של הגישות הנ ל יהיו מועילות.
כאן מוצג פרוטוקול לתרבות מיקרוביאלית של תפוקה גבוהה. מעשה זה פשוט ומשולב בקלות למחקרים קיימים של אינטראקציות מיקרוביאלית. בניגוד לשיטות רבות בשימוש נפוץ לחקר האינטראקציות של חיידקים, השיטה שלנו היא פשוטה, זולה, והיא קלה לחקירת מספר רב של אינטראקציות. מספר זה לא רק קל לביצוע, אבל החומרים זמינים באופן נרחב מרוב ספקי המעבדה או משאבים ציבוריים (למשל, ספריות, makerspaces). כתוצאה מכך, שיטת החקירה הזאת היא יתרון כשורה ראשונה לזיהוי וניתוח דפוסים מעניינים בקרב שילובי זיווגים רבים של מיקרואורגניזמים, שעשויים להועיל במיוחד לחקירת האקולוגיה של מיקרוביאלית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, yellow</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, sterile with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, bacteriological</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSB11000-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filament, white, 3mm diameter</td>
			<td>Keene Village Plastics</td>
			<td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>School Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td>EPIE304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taz 6 3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions

חקר האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים הוביל לתגליות רבות, החל מantimicrobials הרומן ועד לתובנות בתחומי האקולוגיה. גישות רבות המשמשות לחקר אינטראקציות מיקרוביאלית דורשות ציוד מיוחד והינן יקרות ועתירות זמן. נייר זה מציג פרוטוקול לשיתוף פעולה עם תרבות שיתוף, כי הם זולים, מדרגיים למדגם מספרים גדולים, בקלות להתאמה לעיצובים ניסיוניים רבים. מיקרואורגניזמים הם מתורבתים יחד, עם כל המייצגים שילוב אחד זיווגים ומיקרואורגניזמים. אורגניזם מבחן הוא מתורבת בצד אחד של כל היטב מודבטים הראשון בתרבות מונוטוני. לאחר מכן, אורגניזמים היעד מחוסן בו על הצד הנגדי של כל באר באמצעות חותמת החיסון 3D-מודפס. לאחר שיתוף התרבות, השלימה הושלמה הבקיע עבור פנוטיפים חזותיים, כגון צמיחה או עיכוב. מספר זה יכול לשמש כדי לאשר פנוטיפים או לזהות דפוסים בין מבודד של עניין. באמצעות שיטה זו פשוטה ויעילה, משתמשים יכולים לנתח שילובים של מיקרואורגניזמים במהירות וביעילות. זו גישה שיתוף תרבות ישימה לגילוי אנטיביוטי, כמו גם מחקר מבוססי התרבות מיקרובידום והוחל כבר בהצלחה שני יישומים.

האינטראקציה בין שיתוף התרבות יכולה לשמש כדי להבין את האינטראקציות של מיקרוביאלית, לזהות דפוסי עניין ולחשוף מיקרוביאלית באמצעות פעילויות מעניינות. באלה מספר, אורגניזם מבחן הוא מונותרבותי בצד אחד של 12 צלחת אגר היטב ומודונבטים במשך 7 ימים. לאחר מכן, אורגניזם היעד הוא הבחין ...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions at JoVE.com

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

הפרוטוקול שלנו מספק שיטת תפוקה גבוהה לסינון מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאליות בזוגיות בד בבד כדי לזהות אינטראקציות מעניינות שיכולות לסייע במחקר מיקרוביום וגילוי מיקרוביאלי. שיטה זו ישימה בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות במגוון מערכות, כל עוד המיקרואורגניזמים חביבים לתרבות בתנאי מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמשים לסנן מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאליות בתקופה קצרה יחסית של זמן.משתמשים חדשים של טכניקה זו צריך לקחת זמן, במיוחד בעת חינוך צלחות bioassay, כפי שהוא חיוני כדי להיות זהיר כדי למזער את חקלאות יתר או זיהום. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, כי חינוך לוחות bioassay דורש דיוק כדי להבטיח כי האורגניזמים לא להחרים את בארות, כי תרבויות שיתוף אינם מזוהמים. התחל בהכנת תרבויות לילה.השתמש פיפטה סרולוגית להוסיף שלושה מיליליטר של מרק BHI לתוך צינורות תרבות 14 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בלולאת חיסון מיקרוליטר אחת סטרילית כדי לחסן מושבת חיידקים לתוך המרק. מערבלים את הלולאה כדי להבטיח שהגוש יתפזר לתוך המרק.בקצרה מערבולת צינורות התרבות, ו דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 250 סל"ד. ברגע שתרבות החיידקים מגיעות למנת יתר של 600 מעלות מעל אחת, מערבולת אותן כדי לשבור את גושי התאים. הכינו את המדיה PHI עם 1.5% אגר, וערקו אותה באמצעות הפעלה אוטומטית.ואז לקרר את התקשורת ל 55 מעלות צלזיוס באמבט מים מבוקר טמפרטורה, ולחלק שלושה מיליליטר של מדיה BHI מותכת לתוך כל אחת 12 בארות על צלחת, להבטיח כי הבארים הם אפילו ככל האפשר. אז לאפשר אגר להגדיר לילה. לחסן את אורגניזם הבדיקה על צלחת bioassay על ידי החדרת לולאה סטרילית 10 מיקרוליטר חיסון לתוך תרבות הלילה, ו streaking טיפת התרבות על החלק השמאלי של צלחת היטב.חזור על הפעולה עד שכל 12 בארות על הצלחת כבר מחוסן. הדגירה את הצלחות במהופך בטמפרטורה המתאימה במשך שבעה ימים. אם הדגירה בטמפרטורות גדולות או שוות ל-37 מעלות צלזיוס, או באקלים יבש יותר, יש לאחסן את הצלחות במיכל לח כדי למנוע מהן להתייבש.לאחר הדגירה בת ששת הימים של צלחת הביואסאי, הכינו תרבויות לילה של אורגניזם המטרה כמתואר קודם לכן. הכן את צלחת היעד על ידי מילוי כל באר של צלחת ריקה 12 באר עם 1.8 מיליליטר של BHI, ו 200 microliters של תרבות הלילה היעד. מניחים חותמת חיסון סטרילית לתוך לוחית המטרה.מערבבים בעדינות את התרבויות סביב בארות, ומבטיחים שהן לא יזהמו את בארות השכנות. הרם את חותמת החיסון, וודא שיש טיפה של תרבות יעד מדוללת על כל קצה בול. מניחים את חותמת החיסון על צלחת ביו-אסאי לא מחוסן, ומטלטלים בעדינות את החותמת כך שטיפת התרבות חונקת כל באר.לאחר הסרת החותמת, טיפת תרבות צריכה להיות גלויה בארות. אם בארות כלשהן אינן מחוסנות עם חותמת החיסון, ספוט שלושה microliters של תרבות לילה מדוללת על בארות באמצעות פיפטה. לאחר מכן לחסן את הלוחות bioassay כפי שתואר קודם לכן, אבל ליישר את קצות הבול עם הצד הימני של צלחת 12 באר, להבטיח כי החותמת אינה יוצרת קשר עם המושבה החיידקית הקיימת.מוציאים בזהירות את החותמת ומ מניחים אותה בחזרה לתוך לוחית המטרה. אם אגר התגבש בארות בצורה לא אחידה, בעדינות רוק את החותמת קדימה ואחורה, אבל להיזהר לא להעביר את החותמת לתוך הצמיחה אורגניזם הבדיקה. חזור על החיסון עבור כל צלחת bioassay עד שכל הצלחות מחוסנות, ולאחר מכן להחגירה את הצלחות במהופך בטמפרטורה המתאימה במשך שבעה ימים.לאחר שיתוף culturing המבחן ואת האורגניזם היעד במשך שבוע אחד, ציון האינטראקציות מבוסס על הערכה חזותית. ציון הבארות עם צמיחת אורגניזם היעד המציג צמיחה בלתי ניתנת להבחנה מן המונוקולטורה כאפס. ציון בארות עם צמיחה מופחתת כאחד, ואין צמיחה כמו שתיים.הראיה של התרבות ה-שותף המתוארת כאן שימשה להערכת הפעילות המעכבת של אורגניזמים לבדיקת אקטינובקטריה כלפי מיני סטפילוקוקוס שמכוונים לאורגניזמים המבודדים חלל האף האנושי. בסך הכל נבדקו 812 שילובים בזוגות. יש לציין, קורינבקטריום propinquum מעכב מאוד staphylococci שלילי coagulase, במיוחד בהשוואה לקורינבקטריה אחרים כי גם מעכב חלש סטפילוז שלילי staphylococci או לא היו השפעות מעכבות.באמצעות שימוש בגנומיקה השוואתית, זוהה צביר גנים ביוסינתטי לייצור siderophore בגנום ה propinquum של קורינבקטריום. בדיקת אינטראקציה של תרבות-משותף באמצעות מדיום BHI סטנדרטי בתוספת ברזל קבעה כי פנוטיפ העיכוב בין פרופינקום קורינבקטריום ו staphylococci שלילי coagulase היה למעשה תלוי ברזל. חשוב להיות זהיר בעת החתמת הצלחת.בדוק פעמיים כל באר לאחר ההחתמה, וודא שחותמת החיסון מיושרת כראוי כדי למנוע זיהום. לאחר זיהוי אינטראקציות של עניין, מחקרים הבאים באמצעות גנטיקה מיקרוביאלית וגנומיקה, בידוד ואפיון של מוצרים טבעיים, או ספקטרומטריית מסה הדמיה ניתן להשתמש כדי לאפיין מנגנונים שבבסיס אינטראקציות אלה. פרוטוקול זה שימש לאחרונה כדי לחשוף תחרות מתווך siderophore בקרב מיקרוביוטה האף האנושי, וסייע בגילוי של מולקולה אנטי פטרייתית חדשה בשם cyphomycin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...