Name: high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00
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Agradecemos a Daniel May, Marc Chevrette e Don Hoang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho, incluindo os esforços de Cameron R. Currie, foi apoiado pela Universidade de Wisconsin-Madison, gabinete do vice-chanceler de pesquisa e pós-graduação de educação com o financiamento da Wisconsin Alumni Research Foundation, financiamento também fornecido pelo Institutos nacionais de centros de saúde para a excelência da pesquisa translacional (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck foi apoiado por uma biblioteca nacional de medicina de formação de subvenção para a computação e informática em biologia e medicina programa de formação (NLM 5T15LM007359). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e interpretação, ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.

O consentimento informado foi obtido dos pais do doador, e o Comitê de assuntos humanos da Universidade de Wisconsin-Madison aprovou o estudo (Conselho de revisão institucional [IRB] número de aprovação H-2013-1044).
1. cultura da amostra
Nota: Este procedimento é utilizado aqui para o estudo de interações entre bactérias isoladas da cavidade nasal humana. Em princípio, os seguintes métodos são aplicáveis a qualquer condição de cultura....

<ol>
	<li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Communities:+Interactions+to+Scale.">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).</li><li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity.">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li><li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium,+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz&#230;.">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenz&#230;.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+from+Lethal+Bacterial+Competition+through+Coupled+Activation+of+Antibiotic+Resistance+and+a+Mobilized+Subpopulation.">Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation.</a> PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).</li><li>Zipperer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+commensals+producing+a+novel+antibiotic+impair+pathogen+colonization.">Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization.</a> Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).</li><li>Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites.">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li><li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity:+A+review.">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li><li>Heatley, N. 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CLSI document M02-A11. , (2012).</li><li>Adnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculture+of+Marine+Invertebrate-Associated+Bacteria+and+Interdisciplinary+Technologies+Enable+Biosynthesis+and+Discovery+of+a+New+Antibiotic,+Keyicin.">Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin.</a> ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).</li><li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+iChip+for+high+throughput+in+situ+cultivation+of+&amp;#34;uncultivable&amp;#34;+microbial+species.">Use of iChip for high throughput in situ cultivation of &amp;#34;uncultivable&amp;#34; microbial species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li><li>Gonzalez, D. 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C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry,+Metabolism,+and+New+Views+of+the+Microbial+World.">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li><li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry.">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li><li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota.">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li><li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophore-mediated+transport.">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li><li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes.">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).</li></ol>

Antibióticos e outros metabólitos secundários que mediam interações microbianas são úteis para uma infinidade de aplicações, incluindo a descoberta de drogas. Neste documento, é apresentado um protocolo para ensaios de cocultura para avaliar um grande número de interações microbianas. Esses ensaios de interação de cocultura são um meio de throughput simples, acessível, escalável e de alta capacidade para investigar muitas combinações emparelhadas de microrganismos em tandem. Os organismos do alvo são...

Na natureza, os microrganismos raramente existem isoladamente; Consequentemente, eles estão constantemente interagindo com outros organismos. Portanto, estudar como os microrganismos interagem entre si é essencial para a compreensão de uma multiplicidade de comportamentos microbianos1. Interações microbianas podem ser mutualistas, comensais ou antagonistas. Estes em terações podem afetar não somente os micro-organismos eles mesmos mas também os ambientes e os anfitriões que os micro-organismos colonizam1,2.
Muitos cientistas estudam interações microbianas para identificar novas moléculas antimicrobianas. Uma das primeiras moléculas antimicrobianas clinicamente importantes foi encontrada através do estudo das interações microbianas. Sir Alexander Fleming observou um isolado contaminante de Penicillium spp. que inibiu o crescimento de uma cepa de Staphylococcus , o que levou à descoberta da penicilina antibiótica comumente utilizada3. A caracterização dos mecanismos que os microrganismos usam para antagonizar seus concorrentes continua a ser um recurso frutífero para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a estirpe de Streptomyces SP. Mg1 produz linearmicinas antibióticas, que têm uma atividade lítica e degradativa contra Bacillus subtilis4.
Mais, um peptide não-ribosomally sintetizado nomeado lugdunin foi descoberto recentemente após a observação que o Staphylococcus comensal nasal Lugdunensis inibe o Staphylococcus aureus5. Estudos também mostraram que interações mutualistas entre microrganismos são igualmente poderosas como interações antagônicas para a descoberta de moléculas antimicrobianas. Por exemplo, muitas formigas que cultivam fungos na tribo Attini abrigam bactérias simbióticas chamadas Pseudonocardia em seu exoesqueleto que produz moléculas antifúngicas para inibir um patógeno obrigatório de sua cultura fúngica6. Como o estudo das interações microbianas tem sido benéfico para a descoberta de moléculas antimicrobianas, o uso de telas de alta taxa de transferência pode resultar na descoberta de novas moléculas antimicrobianas.
Com relação ao custo e à facilidade de desempenho, as metodologias utilizadas para estudar interações microbianas variam de simples a complexas. Por exemplo, um teste de plugue de agar é um método barato e simples que pode ser usado para investigar o antagonismo entre múltiplos microrganismos7. No entanto, um ensaio de plugue de agar não é um procedimento eficiente e pode ser trabalhoso para muitas combinações emparelhadas. Para avaliar os efeitos de produtos microbialmente produzidos em isolados alvo de interesse de uma forma de alta produtividade, muitos laboratórios utilizam ensaios de difusão de disco8. Estes ensaios são fáceis e baratos e podem ser dimensionáveis para números mais elevados de amostras7. No entanto, este ensaio requer a geração de extratos microbianos e pode produzir resultados enganosos para certas combinações de organismos-alvo e antibióticos, tais como salmonelas e cefalosporinas9.
As abordagens anteriores dependem de componentes isolados para provocar uma resposta em um organismo alvo, em vez de permitir que os microrganismos interajam uns com os outros. Isso é de notar porque as interações entre os micróbios podem provocar a produção de moléculas antimicrobianas "crípticas" que não são produzidas em monocultura. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que a keyicina antimicrobiana só é produzida por um Micromonospora SP. quando cocultivado com um Rhodococcus SP. que é isolado do mesmo microbioma de esponja10. Metodologias de interação mais complexas contornam esse potencial obstáculo à monocultura. Por exemplo, o iChip é útil para isolar bactérias raras e difíceis de cultivar de amostras ambientais e permite a observação de interações microbianas através do crescimento in situ11. Para investigar as interações em detalhe, a espectrometria de massa de imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF-IMS) pode ser usada. Essa abordagem fornece informações detalhadas sobre a composição e distribuição de pequenas moléculas e peptídeos produzidos por colônias microbianas interagindo com alta resolução espacial. MALDI-TOF-IMS também tem sido utilizado em múltiplos estudos de interações bacterianas para caracterizar os mecanismos de competição12,13,14,15. No entanto, MALDI-TOF-IMS muitas vezes requer preparação de amostra trabalhoso, especialização especializada para operar o equipamento, e espectrómetros de massa caros e especializados. Por estas razões, é uma técnica difícil de usar para estudos de alta taxa de transferência. Assim, um ensaio de cocultura simples, escalável e de alta taxa de transferência para interações microbianas que supera muitas limitações das abordagens acima seria benéfico.
Aqui, um protocolo para a cocultura microbiana da taxa de transferência elevada é apresentado. Este ensaio é simples e facilmente incorporado em estudos pré-existentes de interações microbianas. Em contraste com muitos métodos comumente usados para o estudo de interações microbianas, nosso método é simples, barato, e é capaz de investigar um grande número de interações. Estes ensaios não são apenas fáceis de executar, mas os materiais estão amplamente disponíveis a partir da maioria dos fornecedores de laboratórios ou recursos públicos (por exemplo, bibliotecas e makerspaces). Consequentemente, este ensaio é vantajoso como uma primeira linha de investigação para identificar e analisar padrões interessantes entre muitas combinações emparelhadas de microrganismos, o que pode ser especialmente útil para a investigação da ecologia microbiana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, yellow</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, sterile with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, bacteriological</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSB11000-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filament, white, 3mm diameter</td>
			<td>Keene Village Plastics</td>
			<td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>School Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td>EPIE304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taz 6 3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions

O estudo das interações entre microrganismos levou a inúmeras descobertas, desde novos antimicrobianos até insights em ecologia microbiana. Muitas abordagens utilizadas para o estudo das interações microbianas necessitam de equipamentos especializados e são dispendiosas e demoradas. Este artigo apresenta um protocolo para ensaios de interação de cocultura que são baratos, dimensionáveis para grandes números amostrais e facilmente adaptáveis a inúmeros experimentos experimentais. Os microrganismos são cultivados em conjunto, com cada poço representando uma combinação de microrganismos emparelhados. Um organismo de teste é cultivado em um lado de cada poço e primeiro incubado em monocultura. Subsequentemente, os organismos alvo são inoculados simultaneamente no lado oposto de cada poço, utilizando um carimbo de inoculação impresso em 3D. Após a cocultura, os ensaios concluídos são marcados para fenótipos visuais, como crescimento ou inibição. Esses ensaios podem ser usados para confirmar fenótipos ou identificar padrões entre isolados de interesse. Usando este método simples e eficaz, os usuários podem analisar combinações de microrganismos de forma rápida e eficiente. Esta aproximação da cocultura é aplicável à descoberta antibiótica assim como a pesquisa cultura-baseada do microbioma e foi aplicada já com sucesso a ambas as aplicações.

Os ensaios de interação cocultura podem ser usados para compreender as interações microbianas, identificar padrões de interesse e descobrir isolados microbianos com atividades intrigantes. Nestes ensaios, um organismo de teste é monoculcionado em um lado de uma placa de ágar bem 12 e incubada por 7 dias. Subseqüentemente, um organismo do alvo é manchado ao lado do organismo do teste e os dois micróbios foram cocultivados por 7 dias antes de marcar para o phenotype do crescimento...

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High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Os ensaios de interação cocultura apresentados neste protocolo são de baixo custo, alta taxa de transferência e simples. Esses ensaios podem ser usados para observar interações microbianas na cocultura, identificar padrões de interação e caracterizar o potencial inibitório de uma cepa microbiana de interesse contra patógenos humanos e ambientais.

Ensaios de co-cultura de alta produtividade para a investigação de interações microbianas

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Nosso protocolo fornece um método de alto rendimento para triagem de um grande número de interações microbianas em conjunto para identificar interações de interesse que podem ajudar na pesquisa de microbioma e na descoberta antimicrobiana. Este método é facilmente aplicável ao estudo de interações microbianas em uma variedade de sistemas, desde que os microrganismos sejam amáveis à cultura em condições laboratoriais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os usuários trivem um grande número de interações microbianas em um período relativamente curto de tempo.Novos usuários dessa técnica devem levar tempo, especialmente quando vacinam as placas de bioensaio, pois é crucial ter cuidado para minimizar o crescimento excessivo ou a contaminação. A demonstração visual dessa técnica é fundamental, pois a inoculação das placas de bioensaio requer precisão para garantir que os organismos não superem os poços, e que as co-culturas não estejam contaminadas. Comece preparando culturas da noite para o dia.Use uma pipeta sorológica para adicionar três mililitros de caldo BHI em tubos de cultura de 14 mililitros. Em seguida, use um loop inoculante de um microliter estéril para inocular uma colônia bacteriana no caldo. Gire o laço para garantir que a moita se disperse no caldo.Brevemente vórtice os tubos de cultura, e incuba-los durante a noite a 37 graus Celsius em um shaker a 250 RPM. Uma vez que as culturas bacterianas atingem um OD 600 acima de um, vórtice-los para quebrar os aglomerados de células. Prepare a mídia PHI com 1,5% de ágar e esterilize-a autoclaving.Em seguida, esfrie a mídia a 55 graus Celsius em um banho de água controlado pela temperatura, e dispense três mililitros de mídia BHI derretida em cada um dos 12 poços em um prato, garantindo que os poços sejam o mais uniforme possível. Em seguida, deixe o ágar definir durante a noite. Inocular o organismo de teste em uma placa de bioensa de ensaio inserindo um loop inoculante de 10 microliter estéril na cultura da noite para o dia, e espalhando a gota de cultura sobre o terço esquerdo de uma placa bem.Repita até que todos os 12 poços da placa tenham sido inoculados. Incubar as placas de cabeça para baixo na temperatura apropriada por sete dias. Se incubar a temperaturas maiores ou iguais a 37 graus Celsius, ou em climas mais secos, armazene as placas em um recipiente úmido para evitar que sequem.Após a incubação de seis dias da placa de bioensadura, prepare culturas noturnas do organismo alvo como descrito anteriormente. Prepare a placa-alvo preenchendo cada poço de uma placa vazia de 12 poços com 1,8 mililitros de BHI, e 200 microliters da cultura da noite para o dia. Coloque um carimbo de inoculação estéril na placa de destino.Gire suavemente as culturas ao redor dos poços, garantindo que eles não contaminem os poços vizinhos. Levante o carimbo de inoculação e certifique-se de que haja uma gota de cultura de destino diluída em cada ponta de selo. Coloque o carimbo de inoculação em uma placa de bioensa de ensaio não vacinada, e balance suavemente o carimbo para que a cultura caiacula cada poço.Uma vez que o selo é removido, uma gota de cultura deve ser visível nos poços. Se algum poço não for inoculado com o carimbo de inoculação, localizará três microliters de cultura diluída durante a noite nos poços usando uma pipeta. Em seguida, inocular as placas de bioensaio como descrito anteriormente, mas alinhe as pontas de selo com o lado direito da placa de 12 poços, garantindo que o selo não entre em contato com a colônia bacteriana existente.Remova cuidadosamente o carimbo e coloque-o de volta na placa alvo. Se o ágar se solidificou nos poços de forma desigual, balance suavemente o carimbo para frente e para trás, mas tenha cuidado para não transferir o carimbo para o crescimento do organismo de teste. Repita a inoculação para cada placa de bioensauditivo até que todas as placas sejam inoculadas e, em seguida, incubar as placas de cabeça para baixo na temperatura apropriada durante sete dias.Após co-culminar o teste e o organismo alvo por uma semana, marque as interações com base na avaliação visual. Escore os poços com o crescimento do organismo-alvo que exibe crescimento indistinguível da monocultura como zero. Escore os poços com crescimento reduzido como um, e sem crescimento como dois.Os ensaios de cocultura descritos aqui foram utilizados para avaliar a atividade inibitória dos organismos de teste de actinobactérias em direção aos organismos-alvo da espécie staphylococcus isolados da cavidade nasal humana. Um total de 812 combinações em pares foram testadas. Notavelmente, o propinquum de Corynebacterium inibiu fortemente a coagulase negativa de estafilococos, particularmente em comparação com outras Corynebacterias que ou inibiram fracamente o estafilococos negativo da coagulase ou não tinham efeitos inibitórios.Através do uso de genômica comparativa, um aglomerado genético biossintético para produção de siderophore foi identificado no genoma de propinquum corynebacterium. Ensaios de interação co-cultura utilizando o meio BHI padrão e complementado por ferro determinaram que o fenótipo de inibição entre o propinquum de Corynebacterium e o estafilococos negativo coagulase era, na verdade, dependente do ferro. É importante ter cuidado ao estampar a placa.Verifique novamente cada poço após a estampagem e certifique-se de que o selo de inoculação esteja alinhado corretamente para evitar contaminação. Após a identificação de interações de interesse, estudos subsequentes utilizando genética microbiana e genômica, isolamento e caracterização de produtos naturais, ou espectrometria de massa de imagem podem ser usados para caracterizar mecanismos subjacentes a essas interações. Este protocolo foi recentemente usado para descobrir a competição mediada pelo siderophore entre a microbiota nasal humana, e ajudou na descoberta de uma nova molécula antifúngica chamada cifomicina.

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