Name: high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00
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Agradecemos a Daniel May, Marc Chevrette y Don Hoang por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo, incluyendo los esfuerzos de Cameron R. Currie, fue apoyado por la Universidad de Wisconsin-Madison, Oficina del Vicerrectorado de Investigación y Educación de Posgrado con fondos de la Wisconsin Alumni Research Foundation, fondos también proporcionados por la Institutos Nacionales de Centros de Salud para la Excelencia en Investigación Traslacional (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck fue apoyado por una beca de capacitación de la Biblioteca Nacional de Medicina para el Programa de Capacitación en Computación e Informática en Biología y Medicina (NLM 5T15LM007359). Los funderos no tuvieron ningún papel en el diseño, la recopilación de datos y la interpretación del estudio, ni en la decisión de presentar la obra para su publicación.

El consentimiento informado se obtuvo de los padres del donante, y el Comité de Asuntos Humanos de la Universidad de Wisconsin-Madison aprobó el estudio (número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional [IRB] H-2013-1044).
1. Cultura de muestra
NOTA: Este procedimiento se utiliza aquí para el estudio de interacciones entre los aislados de bacterias de la cavidad nasal humana. En principio, los siguientes métodos son aplicables a cualq...

<ol>
	<li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Communities:+Interactions+to+Scale.">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).</li><li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity.">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li><li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium,+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz&#230;.">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenz&#230;.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. 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C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites.">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li><li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity:+A+review.">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li><li>Heatley, N. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+competition+between+Bacillus+subtilis+and+Staphylococcus+aureus+monitored+by+imaging+mass+spectrometry.">Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry.</a> Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).</li><li>Hoefler, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+resistance+to+the+lipopeptide+surfactin+as+identified+through+imaging+mass+spectrometry+of+bacterial+competition.">Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).</li><li>Hoefler, B. C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry,+Metabolism,+and+New+Views+of+the+Microbial+World.">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li><li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry.">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li><li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota.">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li><li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophore-mediated+transport.">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li><li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes.">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).</li></ol>

Los antibióticos y otros metabolitos secundarios que median las interacciones microbianas son útiles para una multitud de aplicaciones, incluido el descubrimiento de fármacos. En este documento, se presenta un protocolo de ensayos de cocultura para evaluar un gran número de interacciones microbianas. Estos ensayos de interacción de cocultivo son un medio simple, asequible, escalable y de alto rendimiento para investigar muchas combinaciones en pares de microorganismos en tándem. Los organismos objetivo se detectan ...

En la naturaleza, los microorganismos rara vez existen de forma aislada; consecuentemente, están constantemente interactuando con otros organismos. Por lo tanto, estudiar cómo los microorganismos interactúan entre sí es esencial para entender una multitud de comportamientos microbianos1. Las interacciones microbianas pueden ser mutualistas, commensales o antagónicas. Estos en las teracciones pueden afectar no sólo a los propios microorganismos, sino también a los ambientes y huéspedes que los microorganismos colonizan1,2.
Muchos científicos estudian las interacciones microbianas para identificar nuevas moléculas antimicrobianas. Una de las primeras moléculas antimicrobianas clínicamente importantes se encontró a través del estudio de interacciones microbianas. Sir Alexander Fleming observó un aislado de Penicillium spp. contaminante que inhibió el crecimiento de una cepa de Staphylococcus, que condujo al descubrimiento de la penicilina antibiótica comúnmente utilizada3. La caracterización de los mecanismos que utilizan los microorganismos para antagonizar a sus competidores sigue siendo un recurso fructífero para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, recientemente se demostró que Streptomyces sp. cepa Mg1 produce linealinas antibióticas, que tienen una actividad lítica y degradante contra Bacillus subtilis4.
Además, un péptido no ribosólomo sintetizado llamado lugdunin fue descubierto recientemente después de la observación de que la comensal nasal Staphylococcus lugdunensis inhibe Staphylococcus aureus5. Los estudios también han demostrado que las interacciones mutualistas entre microorganismos son tan poderosas como las interacciones antagónicas para el descubrimiento de moléculas antimicrobianas. Por ejemplo, muchas hormigas que cultivan hongos en la tribu Attini albergan bacterias simbióticas llamadas Pseudonocardia en su exoesqueleto que produce moléculas antifúngicas para inhibir un patógeno obligatorio de su cultivo de hongos6. Como el estudio de las interacciones microbianas ha sido beneficioso para descubrir moléculas antimicrobianas, el uso de pantallas de alto rendimiento puede dar lugar al descubrimiento de nuevas moléculas antimicrobianas.
Con respecto al costo y la facilidad de rendimiento, las metodologías utilizadas para estudiar las interacciones microbianas van de simples a complejas. Por ejemplo, un ensayo de tapón de agar es un método económico y simple que se puede utilizar para investigar el antagonismo entre múltiples microorganismos7. Sin embargo, un ensayo de tapón de agar no es un procedimiento eficiente y puede ser laborioso para muchas combinaciones por pares. Para evaluar los efectos de los productos producidos microbianamente en los aislados objetivo de interés de una manera de alto rendimiento, muchos laboratorios utilizan ensayos de difusión de discos8. Estos ensayos son fáciles y económicos y pueden ser escalables a un mayor número de muestras7. Sin embargo, este ensayo requiere la generación de extractos microbianos y puede producir resultados engañosos para ciertas combinaciones de organismos objetivo y antibióticos, como Salmonella y cefalosporinas9.
Los enfoques anteriores se basan en componentes aislados para dar lugar a una respuesta en un organismo objetivo, en lugar de permitir que los microorganismos interactúen entre sí. Esto es de nota porque las interacciones entre microbios pueden provocar la producción de moléculas antimicrobianas "crípticas" que no se producen en el monocultivo. Por ejemplo, recientemente se demostró que la keyicina antimicrobiana sólo es producida por un Micromonospora sp. cuando se co-cultiva con un Rhodococcus sp. que se aísla del mismo microbioma de esponja10. Las metodologías de interacción más complejas eluden este posible obstáculo monocultivo. Por ejemplo, el iChip es útil para aislar bacterias raras y difíciles de cultivar a partir de muestras ambientales y permite la observación de interacciones microbianas a través del crecimiento en el situ11. Para investigar las interacciones en detalle, se puede utilizar la desorción/ionización por láser asistida por matriz con espectrometría de masas de imágenes de tiempo de vuelo (MALDI-TOF-IMS). Este enfoque proporciona información detallada sobre la composición y distribución de moléculas pequeñas y péptidos producidos por colonias microbianas interactuando con alta resolución espacial. MALDI-TOF-IMS también se ha utilizado en múltiples estudios de interacciones bacterianas para caracterizar los mecanismos de competencia12,13,14,15. Sin embargo, MALDI-TOF-IMS a menudo requiere una laboriosa preparación de muestras, experiencia especializada para operar el equipo y espectrómetros de masas costosos y especializados. Por estas razones, es una técnica difícil de usar para estudios de alto rendimiento. Por lo tanto, un ensayo de cocultura simple, escalable y de alto rendimiento para interacciones microbianas que supere muchas limitaciones de los enfoques anteriores sería beneficioso.
Aquí, se presenta un protocolo para el cocultivo microbiano de alto rendimiento. Este ensayo es simple y fácilmente incorporado en estudios preexistentes de interacciones microbianas. A diferencia de muchos métodos comúnmente utilizados para el estudio de interacciones microbianas, nuestro método es simple, barato y es susceptible de investigar un gran número de interacciones. Estos ensayos no sólo son fáciles de realizar, sino que los materiales están ampliamente disponibles en la mayoría de los proveedores de laboratorio o recursos públicos (por ejemplo, bibliotecas y espacios de creadores). En consecuencia, este ensayo es ventajoso como primera línea de investigación para identificar y analizar patrones interesantes entre muchas combinaciones de microorganismos en pares, que pueden ser especialmente útiles para la investigación de la ecología microbiana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L disposable polystyrene inoculating loops, yellow</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12000-810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate, sterile with lid</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipet</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, bacteriological</td>
			<td>VWR</td>
			<td>J637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>DSB11000-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filament, white, 3mm diameter</td>
			<td>Keene Village Plastics</td>
			<td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>School Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td>EPIE304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taz 6 3D printer</td>
			<td>Lulzbot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions

El estudio de las interacciones entre microorganismos ha dado lugar a numerosos descubrimientos, desde nuevos antimicrobianos hasta perspectivas en la ecología microbiana. Muchos enfoques utilizados para el estudio de las interacciones microbianas requieren equipos especializados y son costosos e intensivos en tiempo. Este artículo presenta un protocolo para ensayos de interacción de cocultura que son baratos, escalables a grandes números de muestra y fácilmente adaptables a numerosos diseños experimentales. Los microorganismos se cultivan juntos, y cada uno de ellos representa una combinación de microorganismos en pares. Un organismo de prueba se cultiva en un lado de cada pozo y primero se incuba en monocultivo. Posteriormente, los organismos objetivo se inoculan simultáneamente en el lado opuesto de cada pozo utilizando un sello de inoculación impreso en 3D. Después del cocultivo, los ensayos completados se puntúan para fenotipos visuales, como el crecimiento o la inhibición. Estos ensayos se pueden utilizar para confirmar fenotipos o identificar patrones entre aislados de interés. Utilizando este método simple y eficaz, los usuarios pueden analizar combinaciones de microorganismos de forma rápida y eficiente. Este enfoque de cocultura es aplicable al descubrimiento de antibióticos, así como a la investigación de microbiomas basada en cultivos y ya se ha aplicado con éxito a ambas aplicaciones.

Los ensayos de interacción de cocultivo se pueden utilizar para comprender las interacciones microbianas, identificar patrones de interés y descubrir aislados microbianos con actividades intrigantes. En estos ensayos, un organismo de prueba es monocultivo en un lado de una placa de agar de 12 pocillos e incubado durante 7 días. Posteriormente, un organismo objetivo se detecta junto al organismo de ensayo y los dos microbios fueron co-cultivados durante 7 días antes de puntuar para el ...

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High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.

Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Nuestro protocolo proporciona un método de alto rendimiento para el cribado de un gran número de interacciones microbianas en pares en conjunto para identificar interacciones de interés que pueden ayudar a la investigación del microbioma y el descubrimiento de antimicrobianos. Este método es fácilmente aplicable al estudio de las interacciones microbianas en una variedad de sistemas, siempre y cuando los microorganismos sean amables con el cultivo en condiciones de laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los usuarios examinar un gran número de interacciones microbianas en un período relativamente corto de tiempo.Los nuevos usuarios de esta técnica deben tomar tiempo, especialmente al inocular las placas de bioensayo, ya que es crucial tener cuidado de minimizar el crecimiento excesivo o la contaminación. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que la inoculación de las placas de bioensayo requiere precisión para garantizar que los organismos no sobreculpistan los pozos, y que los co-cultivos no están contaminados. Comience por preparar culturas de la noche a la mañana.Utilice una pipeta serológica para añadir tres mililitros de caldo BHI en tubos de cultivo de 14 mililitros. Luego usa un bucle de inoculación estéril de un microlitro para inocular una colonia bacteriana en el caldo. Gire el lazo para asegurarse de que el grupo se dispersa en el caldo.Vórtice brevemente los tubos de cultivo, e incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados en una coctelera a 250 RPM. Una vez que los cultivos bacterianos alcanzan un OD 600 por encima de uno, vórqueles para romper los grupos de células. Prepare medios de PHI con 1,5% de agar y ele por autoclaving.A continuación, enfríe los medios a 55 grados centígrados en un baño de agua con temperatura controlada, y dispensa tres mililitros de medios BHI fundidos en cada uno de los 12 pozos en una placa, asegurando que los pozos sean lo más uniforme posible. Luego deja que el agar se ponga durante la noche. Inocular el organismo de prueba en una placa de bioensayo mediante la inserción de un bucle de inoculación estéril de 10 microlitro en el cultivo de la noche, y rayar la gota de cultivo sobre el tercio izquierdo de un pozo de placa.Repita hasta que se hayan inoculado los 12 pozos de la placa. Incubar las placas boca abajo a la temperatura adecuada durante siete días. Si incuba a temperaturas superiores o iguales a 37 grados centígrados, o en climas más secos, guarde las placas en un recipiente húmedo para evitar que se sequen.Después de la incubación de seis días de la placa de bioensayo, preparar cultivos nocturnos del organismo objetivo como se describió anteriormente. Prepare la placa de destino llenando cada pozo de una placa vacía de 12 pozos con 1,8 mililitros de BHI y 200 microlitros del cultivo nocturno objetivo. Coloque un sello de inoculación estéril en la placa de destino.Arremete suavemente con las culturas alrededor de los pozos, asegurándose de que no se contaminen los pozos vecinos. Levante el sello de inoculación y asegúrese de que haya una gota de cultivo de destino diluido en cada punta de sello. Coloque el sello de inoculación en una placa de bioensayo sin inocular, y mece suavemente el sello para que la gota de cultivo inocule cada pocillo.Una vez que se retira el sello, una gota de cultivo debe ser visible en los pozos. Si no se inocula ningún poz de pozo con el sello de inoculación, detecte tres microlitros de cultivo diluido durante la noche en los pozos utilizando una pipeta. A continuación, inocular las placas de bioensayo como se describió anteriormente, pero alinear las puntas del sello con el lado derecho de la placa de 12 pozos, asegurando que el sello no entra en contacto con la colonia bacteriana existente.Retire con cuidado el sello y colóquelo de nuevo en la placa de destino. Si el agar se ha solidificado en los pozos de manera desigual, mezcle suavemente el sello de un lado a otro, pero tenga cuidado de no cambiar el sello al crecimiento del organismo de prueba. Repita la inoculación para cada placa de bioensayo hasta que se inoculen todas las placas, luego incubar las placas boca abajo a la temperatura adecuada durante siete días.Después de co-cultivar la prueba y el organismo objetivo durante una semana, puntuar las interacciones basadas en la evaluación visual. Puntuar los pozos con el crecimiento del organismo objetivo que exhibe un crecimiento indistinguible del monocultivo como cero. Puntuar los pozos con un crecimiento disminuido como uno, y ningún crecimiento como dos.Los ensayos de co-cultivo descritos aquí se utilizaron para evaluar la actividad inhibitoria de los organismos de prueba de actinobacteria hacia los organismos diana de la especie estafilococo aislados de la cavidad nasal humana. Se probaron un total de 812 combinaciones por pares. En particular, Corynebacterium propinquum inhibió fuertemente los estafilococos negativos de coagulasa, particularmente en comparación con otras Corynebacterias que ya sea inhibió débilmente los estafilococos negativos de coagulasa o no tenía efectos inhibitorios.Mediante el uso de genómica comparativa, se identificó un grupo de genes biosintéticos para la producción de sideróforos en el genoma de Corynebacterium propinquum. Los ensayos de interacción de co-cultivo utilizando un medio BHI estándar y complementado con hierro determinaron que el fenotipo de inhibición entre Corynebacterium propinquum y coagulase negative staphylococci dependía en realidad del hierro. Es importante tener cuidado al estampar la placa.Compruebe cada pozo después del estampado y asegúrese de que el sello de inoculación esté alineado correctamente para evitar la contaminación. Después de identificar interacciones de interés, se pueden utilizar estudios posteriores utilizando genética microbiana y genómica, aislamiento y caracterización de productos naturales o espectrometría de masas por imágenes para caracterizar los mecanismos subyacentes a estas interacciones. Este protocolo se ha utilizado recientemente para descubrir la competencia mediada por sideróforo entre la microbiota nasal humana, y ayudó en el descubrimiento de una nueva molécula antifúngica llamada cihitomicina.

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