Name: ovarian cancer detection using photoacoustic flow cytometry
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Madeleine Howell for hennes hjelp med syntese, Matthew Chest for hans hjelp designe Flow-systemet, og Ethan Marschall for å få hjelp med SolidWorks.

1. nanopartikkel syntese og Funksjonalisering
Merk: syntese av FA-CuS NPs oppnås ved hjelp av en pott syntese metode som er tilpasset fra en tidligere publisert protokoll21. FORSIKTIG: alle syntese skal forekomme i en ventilert kjemisk avtrekks hette.
<ol><li>Før syntese, filter ca 300 mL deionisert (DI) vann om et 0,2 μm sterilt filter.</li>
	<li>Rengjør et 250 mL glass rund bunn kolbe med et vaskemiddel og skyll med DI vann. Tilsett 0,0134 g CuCl2 ...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018:+GLOBOCAN+sources+and+methods.">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker.">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+HE4++circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer.">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li><li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA.">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).</li><li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo.">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li><li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry.">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li><li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry:+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles,+pathogens,+and+contrast+dyes+in+vivo.">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li><li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+micropipette.">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103 (2018).</li><li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe.">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li><li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry.">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li><li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow.">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo.">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+enrichment,+photoacoustic+diagnosis,+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles.">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).</li><li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets:+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging.">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li><li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis.">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).</li><li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm.">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li><li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay.">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li><li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment.">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).</li><li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy.">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li><li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles.">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+(CTCs)+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer.">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li><li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel.">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry.">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li><li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry.">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).</li><li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents.">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma.">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis.">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells.">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).</li></ol>

Denne protokollen er en grei metode for påvisning av eggstokkene CTC utnytte PAFC og en målrettet CuS kontrastmiddel. Mange metoder har blitt utforsket for påvisning av eggstokkene CTC, inkludert mikrovæskebasert enheter, RT-PCR, og fluorescens Flow flowcytometri23,24,25. Disse varierer i kompleksitet, kostnader og nøyaktighet, og begrenser effektiviteten i kliniske innstillinger. PAFC introduserer flere fordeler fremfor di...

Kreft i eggstokkene er en av de farligste gynekologisk ondartede og resulterte i anslagsvis 184 800 dødsfall over hele verden i 20181. Flere studier har vist sammenhengen mellom kreft progresjon for eggstokkene (dvs. metastasering) og tilstedeværelsen av CTC2,3,4. Den vanligste metoden for deteksjon og isolering av CTC utnytter Cellsearch systemet, som er rettet mot EpCam reseptoren5. EpCam uttrykk er imidlertid downregulated i epitel til mesenchymal overgang, som har vært innblandet i kreft metastasering6. Til tross for fremskritt, dagens kliniske teknologier fortsatt lider av lav nøyaktighet, høye kostnader og kompleksitet. På grunn av disse ulempene, nye teknologier for oppdagelsen og opplisting av eggstokkene CTC har blitt et viktig område for forskning.
Nylig dukket PAFC som en effektiv metode for de ikke-invasiv påvisning av kreftceller, analyse av nanomaterialer, og identifisering av bakterier7,8,9. PAFC skiller seg fra tradisjonelle fluorescens Flow flowcytometri ved å oppdage analytter i flyt ved å utnytte photoacoustics. Photoacoustic-effekten genereres når laser lyset absorberes av et materiale som forårsaker thermoelastic ekspansjon, og produserer en akustisk bølge som kan oppdages av en ultralyd svinger10,11. Fordeler med PAFC over tradisjonelle flyt flowcytometri metoder inkluderer enkelhet, enkel oversettelse til kliniske innstillinger, og påvisning av CTC på enestående dybder i pasientprøver12,13. Nyere studier har benyttet PAFC systemer for påvisning av celler ved hjelp av endogene og eksogene kontrast14,15. Nær infrarød (NIR) lett absorberende kontrastmidler som indocyanine Green Dye, og metall NPs (f. eks gull og CuS) har blitt brukt for selektiv merking av celler og vev i kombinasjon med photoacoustic Imaging16,17,18. På grunn av den forbedrede gjennomtrengning dybden av NIR lys innen biologisk vev, photoacoustic deteksjon av dempere kan utføres på større dybder for kliniske anvendelser. På grunn av sitt store potensial for bruk i klinikken, har kombinasjonen av målrettede NIR kontrast agenter med PAFC generert betydelig interesse for påvisning av CTC.
PAFC i kombinasjon med målrettede kontrastmidler gir en forbedret tilnærming for analyse av pasientprøver med høy gjennomstrømming, med forbedret nøyaktighet og målrettet påvisning av CTC. En av de viktigste oppdagelsen strategier for CTC er den spesifikke målretting av membran proteiner til stede på cellen av interesse. En bemerkelsesverdig karakteristisk for eggstokkene CTC er overuttrykte av folat-reseptorer som ligger på deres ytre membran19. Folat reseptor målretting er en ideell strategi for identifisering av eggstokkene CTC i blodet fordi endogene celler, som har høyere uttrykk for folsyre reseptorer, er generelt luminal og har begrenset eksponering for blodet20. Kobber sulfid NPs (CuS NPs) har nylig blitt anerkjent for deres evne til å målrette folat-reseptorer uttrykt på kreftceller21. Kombinert med deres biokompatibilitet, enkel syntese, og absorpsjon dypt i NIR, disse NP kontrast agentene gjør en ideell målretting strategi for påvisning av eggstokkene CTC utnytte PAFC.
Dette arbeidet beskriver utarbeidelse av FA-CuS NPs og deres bruk for påvisning av eggstokkene kreftceller i et photoacoustic Flow system. CuS NPs er modifisert med folsyre å spesifikt målrette eggstokkene CTC og avgir et photoacoustic signal når stimulert med en 1 053 NM laser. Resultatene indikerer vellykket påvisning av eggstokkene kreftceller inkubert med disse photoacoustic kontrastmidler innenfor PAFC systemet. Disse resultatene viser deteksjon av kreftceller for eggstokkene ned til konsentrasjoner av 1 celle/μL, og fluorescens mikroskopi bekrefter vellykket opptak av disse partiklene ved SKOV-3 eggstokkene kreftceller22. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av FA-CuS NPs syntese, utarbeidelse av prøver for fluorescens mikroskopi, bygging av photoacoustic Flow system, og photoacoustic deteksjon av eggstokkene kreftceller. Den presenterte metoden viser vellykket identifisering av eggstokkene CTC i flyt utnytte FA-CuS NPs. Future arbeid vil fokusere på klinisk anvendelse av denne teknologien mot tidlig påvisning av eggstokkene kreft metastasering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin With EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m 1000 mL Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-440</td>
			<td>For filtering larger volumes of DI water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Tank</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe-5170R</td>
			<td>250 MS/s, 8-Channel, 14-bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242985-1.8KG</td>
			<td>Detergent used for cleaning glassware.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hematocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Chloride</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>206532500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMH-10x-532</td>
			<td>To couple pulsed light to optical fiber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Stage</td>
			<td>Newport</td>
			<td>F-91-C1-T</td>
			<td>Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>Model CPX3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI LabVIEW 2017 (32-bit)</td>
			<td>LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Matlab R2016a</td>
			<td>Reconstructions and graphs produced using Matlab software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Chuck</td>
			<td>Newport</td>
			<td>FPH-DJ</td>
			<td>Used to hold the bare fiber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Coupler</td>
			<td>Newport</td>
			<td>FP-1A</td>
			<td>3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Coated TEM Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-CU-SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-Ject 10 mL Syringes</td>
			<td>HENKE SASS WOLF</td>
			<td>4100-X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG550LEC</td>
			<td>Used to expose sample to pulsed light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed Laser</td>
			<td>RPMC Lasers Inc</td>
			<td>Quantus-Q1D-1053</td>
			<td>Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser/Receiver</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5077PR</td>
			<td>Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary Tube</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>QF150-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27016-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone</td>
			<td>Momentive Performance Materials, Inc.</td>
			<td>GE284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Beads</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfide Nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431648-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc</td>
			<td>DUAL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1949071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Olynmpus</td>
			<td>V214-BB-RM</td>
			<td>Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution .4%</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
			<td>Ultrasound gel for transducer coupling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ovarian cancer detection using photoacoustic flow cytometry

Mange studier tyder på at opplisting av sirkulerende tumorceller (CTC) kan vise løftet som et Prognostisk verktøy for eggstokkene kreft. Gjeldende strategier for påvisning av CTC inkluderer Flow flowcytometri, mikrovæskebasert enheter, og sanntids polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR). Til tross for nylige fremskritt, metoder for påvisning av tidlig eggstokkene kreft metastasering fortsatt mangler følsomhet og spesifisitet som kreves for klinisk oversettelse. Her er en ny metode presentert for påvisning av eggstokkene sirkulerende tumorceller ved photoacoustic Flow flowcytometri (PAFC) bruker en tilpasset tredimensjonal (3D) trykt system, inkludert en Flow kammer og sprøyte pumpen. Denne metoden utnytter folsyre-avkortet kobber sulfid nanopartikler (FA-CuS NPs) til målet SKOV-3 eggstokkene kreftceller ved PAFC. Dette arbeidet demonstrerer affinitet av disse kontrast agentene for eggstokkene kreftceller. Resultatene viser NP karakterisering, PAFC deteksjon, og NP opptak av fluorescens mikroskopi, og dermed demonstrere potensialet i denne romanen system for å oppdage eggstokkene CTC på fysiologisk relevante konsentrasjoner.

Figur 1a viser en typisk tem bilde av syntetisert nanopartikler. Den gjennomsnittlige størrelsen på den typiske nanopartikkel er ca 8,6 NM ± 2,5 NM. Nanopartikkel måling ble utført i ImageJ. Det ble brukt terskel-og vannskille funksjoner for å skille partiklene for måling. Den horisontale og vertikale diameter av hver partikkel ble målt vinkelrett på hverandre og ytterligere gjennomsnitt. For DLS er en representativ måling vist i <s...

Watch this Scientific Journal Video about Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry at JoVE.com

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

En protokoll er presentert for å oppdage sirkulerende eggstokkene tumorceller benytter en skreddersydd photoacoustic Flow system og målrettede folsyre-avkortet kobber sulfid nanopartikler.

Kreft deteksjon av eggstokkene bruke Photoacoustic Flow flowcytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Nåværende kliniske ovariekreftdeteksjonstiltak er uspesifikke og mangelpunkt for omsorgsdeteksjon av sirkulerende tumorceller. Vårt fotoakustiske strømningssystem gjør det mulig å teste pasientprøver for spesifikke eggstokkreftmarkører i blodet. Denne prosedyren gir en unik plattformteknologi med forbedringer over dagens teknikker når det gjelder enkelhet, lave kostnader, lovende begrensninger for deteksjon og evne til å brukes på brede applikasjoner.Gjennom dette arbeidet tar vi sikte på å bygge ut av vårt målrettede nanopartikkelsystem for eggstokkreft for å teste ex vivo pasientprøver for CTCer. Dette svært allsidige PAFC-systemet er i stand til å utvide for klinisk bruk, og tester tilstedeværelsen av et bredt spekter av biomarkører i blodet. Riktig optisk justering er avgjørende for påvisning av mål i det fotoakustiske strømningscytometrisystemet.Videre, for å sikre riktig akustisk kobling, sørg for at det ikke er noen bobler mellom glasslysbildet og svingeren. På grunn av det egendefinerte natur flytsystemet og dets komponenter, visualisering av metoden er gunstig for nøyaktig reproduksjon. I en ventilert kjemisk røykhette filtrerer du ca. 300 milliliter av deionisert vann gjennom et sterilt 0,2 mikrometerfilter.Tilsett 0,0134 gram kobberklorid og 100 ml deionisert vann til en ren 250 milliliter rund bunnkolbe for å skape en en millimolar kobberkloridløsning. Tilsett 0,015 gram folsyre i kolben og bruk en magnetisk rørestang til å blande løsningen i ca. fem minutter. Bland deretter 0,024 gram natriumsulfid nonahydrat med 100 mikroliter av deionisert vann.Bruk en 200 mikroliter pipette til å sakte legge denne oppløsningen til reaksjonsblandingen over en varighet på ca. 10 sekunder. Cap reaksjonsbeholderen. Plasser fartøyet i et oljebad satt til 90 grader Celsius og fortsett å røre.Etter ca. 15 minutter eller når oljebadet har nådd temperaturområdet mellom 85 og 90 grader Celsius, la reaksjonen fortsette i en ekstra time. Når reaksjonen er fullført, fjern reaksjonsbeholderen fra oljebadet og la det avkjøles ved romtemperatur i 10 til 15 minutter før den overføres til et isbad. Når reaksjonen er avkjølt, juster pH til ca. 10 ved hjelp av en molarnatriumhydroksid.Tilsett blandingen til en 30 kilodalton sentrifugeringskolonne i 15 milliliter partier og sentrifuge ved 3, 082 ganger g i 15 minutter for å rense reaksjonsblandingen. Bland først folsyre avkortet kobbersulfid nanopartikler ved riktig konsentrasjon i friske RPMI media. Tilsett denne nanopartikkelløsningen i hver brønn av den tilberedte 24-brønnsplaten som inneholder SK-OV-3-celler med en konsentrasjon på 400 mikrogram per milliliter.Inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i to timer. Etter dette, trypsinize cellene med 0,5 milliliter på 0,25% trypsin og EDTA. For å nøytralisere trypsin, tilsett minst en milliliter folsyrefri RPMI 1640 komplett vekstmedia og sentrifuge cellene på 123 ganger g i seks minutter.For å vaske cellene, fjern det overnaturlige, resuspend cellene i to milliliter PBS og sentrifuge på 123 ganger g i seks minutter. Gjenta dette vasketrinnet to ganger for å fjerne eventuelle ubound nanopartikler. Deretter gjenbruker cellene med en til to milliliter av en 2% Tween-løsning i PBS.Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og Trypan Blue. Fortynn cellene i en løsning på 2% Tween i PBS til den valgte konsentrasjonen for deteksjon. Bruk den medfølgende tredimensjonale STL-filen til å skrive ut strømningstanken med enten ABS termoplast eller PLA-plast.Etter at du har booket ut tanken, rengjør og monter systemet for bruk. Plasser glassdeksler over en millimeter med tre millimeter spor og en centimeter hull i strømningssystemet og forsiktig forsegle med silikon for å hindre lekkasje. Deretter monterer kapillærrøret inn i silikonherdede rørene.Sett rørene inn i strømningskammeret gjennom siden av strømningstanken slik at glasskapillærrøret er rett over og foran tre millimetersporet og ett centimeter hull. Forsegle slangen med silikon. Koble deretter svingeren til en ultralydpulser og mottaker.Forsterk signalet med en 59 desibelforsterkning. Koble utgangen av filteret til et flerbruks rekonfigurerbart oscilloskop utstyrt med et innebygd felt programmerbar portarray. Koble et av rørene som kommer fra strømningskammeret til et T-kryss som er koblet til to sprøytepumper ved hver gren.Fyll en av sprøytepumpene med luft og den andre pumpen med prøven som skal analyseres. Sett pumpen som inneholder luft til en strømningshastighet på 40 mikroliter per minutt, og sett pumpen som inneholder prøven til en strømningshastighet på 20 mikroliter per minutt. Deretter kobler du det gjenværende røret ut av strømningssystemet til en beholder med 10 % blekemiddel for å kaste celler etter at de har gått ut av strømningssystemet.Plasser den delen av kvartskapillærrøret i direkte justering med transduseren i feltvisningen av mikroskopet for å tillate forsiktig plassering av den optiske fiberen over prøven slik at den lyser hele bredden av røret. Bestråle prøven ved hjelp av en optisk fiber kanalisere en diode-pumpet solid-state laser opererer med en bølgelengde på 1, 053 nanometer. Bruk et mikroskopmontert kamera for å registrere strømmen, avfyringen av laseren og passering av prøver gjennom strømningssystemet.I denne studien brukes fotoakustisk strømningscytometri og det målrettede kobbersulfidmålrettingsmiddelet til å oppdage ovariesirkulasjonstumorceller. Et typisk TEM-bilde av de syntetiserte nanopartiklene viser at den gjennomsnittlige størrelsen på en typisk nanopartikkel er ca. 8,6 nanometer. De horisontale og vertikale diameterne til hver partikkel måles deretter vinkelrett på hverandre og ytterligere gjennomsnitt.Den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren for disse partiklene er 73,6 nanometer. Kobbersulfid nanopartikler har en karakteristisk absorbanskurve som strekker seg inn i nær infrarød. Det er en liten artefakt rundt 850 nanometer som er forårsaket av veksling av lasere av spektrofotometeret.Fluorescens mikroskopi bilder av celler inkubert med fluorescerende merkede nanopartikler viser at nanopartikkelopptak kan visualiseres ved tilstedeværelse av fluorescens over cellen. Celler som ikke inkuberes med nanopartikler, viser ingen fluorescerende signal. Tilstedeværelsen av dette fluorescerende signalet indikerer vellykket opptak av partiklene og deres evne til å bli oppdaget i strømningssystemet.Eksempler på typiske datainnsamlingssignaler vises her. Rådataene indikerer forskjellene i signal mellom nanopartikkelkodede celler, PBS og folsyre avkortet kobbersulfid nanopartikler. Ved hjelp av tilpasset laboratorievisning og MATLAB-programvare, er bilderekonstruksjoner laget av de positive og negative kontrollene i henholdsvis sanntid og etter oppkjøp.Individuelle konvolutter konverteres deretter til pikselverdier og vises som uavhengige kolonner. Klare forskjeller i fotoakustisk signal oppstår mellom PBS og folsyre avkortet kobbersulfid nanopartikler med en konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter. Under denne prosedyren er det viktig å justere ultralydtransduseren, mikroskopet og fiberoptisk i det fotoakustiske strømningscytometrisystemet.Bekreft systemjusteringen ved å teste positive og negative kontroller. På grunn av allsidigheten til fotoakustiske målrettingsteknikker og det brede spekteret av applikasjoner som er mulige ved hjelp av PAFC, baner denne teknikken vei for oversettelsesmessig viktige kliniske og forskningsapplikasjoner. For å sikre klinisk anvendelse bør videre studier fokusere på testing av pasientprøver og reduksjon av prosessuelle skritt.Syntesen av nanopartiklene skal skje i en kjemisk røykhette ved hjelp av riktig verneutstyr. Menneskelige cellelinjer må håndteres i henhold til institusjonens retningslinjer. Bruk av laseren krever strålingssikkerhetsopplæring og passende PPE.Laserbruk og fotoakustisk testing bør bare utføres av høyt utdannet personell.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Deteksjon og Isolering av Sirkulerende Melanom Cells bruke photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Integrert Photoacoustic ophthalmoscopy og Spectral-domene optisk koherens tomografi

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Photoacoustic Cystography

Photoacoustic cystografi

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field fluoriserende mikroskopi og fluoriserende Imaging flowcytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering og Relativ Kvantifisering av karbonnanorør i Celler med Multispectral Imaging flowcytometrisystemer

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Påvisning av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flowcytometrisystemer

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellering Eggstokkreft Flercellede spheroid Opptreden i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...