Name: ovarian cancer detection using photoacoustic flow cytometry
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry at JoVE.com

A los autores les gustaría reconocer a Madeleine Howell por su ayuda con la síntesis, Matthew Chest por su ayuda para diseñar el sistema de flujo, y Ethan Marschall para ayudar con SolidWorks.

1. Síntesis y funcionalización de nanopartículas
NOTA: La síntesis de los NP FA-CuS se logra utilizando un método de síntesis de un pozo adaptado de un protocolo publicado previamente21. ADVERTENCIA: Toda la síntesis debe ocurrir en una campana de humo súcto sordo químico ventilada.
<ol><li>Antes de la síntesis, filtre aproximadamente 300 ml de agua desionizada (DI) a través de un filtro estéril de 0,2 m.</li>
	<li>Limpie un matraz de fondo redondo de v...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018:+GLOBOCAN+sources+and+methods.">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker.">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873 (2015).</li><li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+HE4++circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer.">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li><li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA.">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li><li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition.">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178 (2012).</li><li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo.">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li><li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry.">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li><li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry:+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles,+pathogens,+and+contrast+dyes+in+vivo.">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li><li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+micropipette.">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103 (2018).</li><li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe.">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li><li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry.">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li><li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow.">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo.">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11 (2016).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+enrichment,+photoacoustic+diagnosis,+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles.">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557 (2012).</li><li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets:+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging.">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li><li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis.">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327 (2017).</li><li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm.">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li><li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay.">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li><li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment.">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553 (2016).</li><li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy.">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li><li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles.">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+(CTCs)+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer.">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li><li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel.">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry.">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li><li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry.">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007 (2016).</li><li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents.">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma.">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857 (2019).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis.">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li><li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells.">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855 (2009).</li></ol>

Este protocolo es un método sencillo para la detección de CtC ováricos utilizando PAFC y un agente de contraste CuS objetivo. Se han explorado muchos métodos para la detección de CTCová, incluidos dispositivos microfluídicos, RT-PCR y citometría de flujo de fluorescencia23,24,25. Estos varían en complejidad, costo y precisión, limitando su eficacia en entornos clínicos. PAFC introduce varias ventajas sobre estos méto...

El cáncer de ovario es una de las neoplasias malignas ginecológicas más mortíferas y resultó en unas 184.800 muertes en todo el mundo en 20181. Múltiples estudios han demostrado la correlación entre la progresión del cáncer de ovario (es decir, metástasis) y la presencia de CTCs2,3,4. El método más común para la detección y aislamiento de CTCs utiliza el sistema Cellsearch, que se dirige al receptor EpCam5. La expresión EpCam, sin embargo, está regulada en la transición epitelial a mesenquimal, que se ha implicado en la metástasis del cáncer6. A pesar de los avances, las tecnologías clínicas actuales todavía sufren de baja precisión, alto costo y complejidad. Debido a estos inconvenientes, las nuevas tecnologías para el descubrimiento y la enumeración de CTCs ováricos se han convertido en un área importante para la investigación.
Recientemente, PAFC surgió como un método eficaz para la detección no invasiva de células cancerosas, análisis de nanomateriales, y la identificación de bacterias7,8,9. PAFC se diferencia de la citometría de flujo de fluorescencia tradicional mediante la detección de analitos en el flujo mediante la utilización de fotoacústica. El efecto fotoacústico se genera cuando la luz láser es absorbida por un material que provoca la expansión termoelástica, produciendo una onda acústica que puede ser detectada por un transductor de ultrasonido10,11. Las ventajas de PAFC sobre los métodos tradicionales de citometría de flujo incluyen simplicidad, facilidad de traducción a entornos clínicos y detección de CTCs a profundidades sin precedentes en muestras de pacientes12,13. Estudios recientes han utilizado sistemas PAFC para la detección de células utilizando contraste endógeno y exógeno14,15. Para el etiquetado selectivo de células y tejidos, en combinación con imágenes fotoacústicas16,17,18,se han utilizado agentes de contraste de infrarrojo cercano (NIR), como el tinte verde indocyanina, y los NP metálicos (por ejemplo, oro y CuS). Debido a la mejora de la profundidad de penetración de la luz NIR dentro de los tejidos biológicos, la detección fotoacústica de absorbentes se puede realizar a mayores profundidades para aplicaciones clínicas. Debido a su gran potencial de uso en la clínica, la combinación de agentes de contraste NIR dirigidos con PAFC ha generado un interés considerable para la detección de CTCs.
PAFC en combinación con agentes de contraste específicos proporciona un enfoque mejorado para el análisis de alto rendimiento de muestras de pacientes con mayor precisión y detección dirigida de CTCs. Una de las principales estrategias de detección de los CTC es la orientación específica de las proteínas de membrana presentes en la célula de interés. Una característica notable de los CTC ováricos es la sobreexpresión de los receptores de folato ubicados en su membrana externa19. La focalización de los receptores de folato es una estrategia ideal para la identificación de los CTC ováricos en la sangre porque las células endógenas, que tienen una mayor expresión de receptores de ácido fólico, son generalmente luminales y tienen una exposición limitada al torrente sanguíneo20. Los NP de sulfuro de cobre (PP de CuS) han sido reconocidos recientemente por su capacidad para atacar los receptores de folato expresados en células cancerosas21. Combinados con su biocompatibilidad, facilidad de síntesis y absorción profunda en el NIR, estos agentes de contraste NP hacen una estrategia de apuntamiento ideal para la detección de CtCovás que utilizan PAFC.
Este trabajo describe la preparación de los NP FA-CuS y su uso para la detección de células cancerosas de ovario en un sistema de flujo fotoacústico. Los NP de CuS se modifican con ácido fólico para apuntar específicamente a los CTC ováricos y emiten una señal fotoacústica cuando se estimulan con un láser de 1.053 nm. Los resultados indican la detección exitosa de células cancerosas ováricas incubadas con estos agentes de contraste fotoacústicos dentro del sistema PAFC. Estos resultados muestran la detección de células cancerosas de ovario hasta concentraciones de 1 célula/L, y la microscopía de fluorescencia confirma la aceptación exitosa de estas partículas por las células cancerosas de ovario SKOV-322. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la síntesis de LOS NP FA-CuS, la preparación de muestras para la microscopía de fluorescencia, la construcción del sistema de flujo fotoacústico y la detección fotoacústica de células cancerosas ováricas. El método presentado muestra una identificación exitosa de los CTC ováricos en el flujo utilizando NP FA-CuS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025% Trypsin With EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-053-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m 1000 mL Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-440</td>
			<td>For filtering larger volumes of DI water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printed Tank</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition Card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe-5170R</td>
			<td>250 MS/s, 8-Channel, 14-bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alconox</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242985-1.8KG</td>
			<td>Detergent used for cleaning glassware.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hematocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Chloride</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>206532500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Objective</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LMH-10x-532</td>
			<td>To couple pulsed light to optical fiber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Stage</td>
			<td>Newport</td>
			<td>F-91-C1-T</td>
			<td>Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>Model CPX3800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI LabVIEW 2017 (32-bit)</td>
			<td>LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing Software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Matlab R2016a</td>
			<td>Reconstructions and graphs produced using Matlab software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Chuck</td>
			<td>Newport</td>
			<td>FPH-DJ</td>
			<td>Used to hold the bare fiber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Coupler</td>
			<td>Newport</td>
			<td>FP-1A</td>
			<td>3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Coated TEM Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-CU-SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-Ject 10 mL Syringes</td>
			<td>HENKE SASS WOLF</td>
			<td>4100-X00V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG550LEC</td>
			<td>Used to expose sample to pulsed light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed Laser</td>
			<td>RPMC Lasers Inc</td>
			<td>Quantus-Q1D-1053</td>
			<td>Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulser/Receiver</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5077PR</td>
			<td>Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary Tube</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>QF150-75-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27016-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone</td>
			<td>Momentive Performance Materials, Inc.</td>
			<td>GE284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKOV-3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Beads</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfide Nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431648-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pumps</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc</td>
			<td>DUAL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1949071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Olynmpus</td>
			<td>V214-BB-RM</td>
			<td>Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution .4%</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound Gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic 100</td>
			<td>Ultrasound gel for transducer coupling</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ovarian cancer detection using photoacoustic flow cytometry

Muchos estudios sugieren que la enumeración de las células tumorales circulantes (CTC) puede mostrar promesa como una herramienta de pronóstico para el cáncer de ovario. Las estrategias actuales para la detección de CTC incluyen citometría de flujo, dispositivos microfluídicos y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). A pesar de los avances recientes, los métodos para la detección de metástasis temprana del cáncer de ovario todavía carecen de la sensibilidad y especificidad necesarias para la traducción clínica. Aquí, se presenta un método novedoso para la detección de células tumorales circulantes ováricas por citometría de flujo fotoacústico (PAFC) utilizando un sistema impreso tridimensional personalizado (3D), incluyendo una cámara de flujo y una bomba de jeringa. Este método utiliza nanopartículas de sulfuro de cobre cubiertas de ácido fólico (PN FA-CuS) para atacar las células cancerosas de ovario SKOV-3 por PAFC. Este trabajo demuestra la afinidad de estos agentes de contraste para las células cancerosas de ovario. Los resultados muestran la caracterización NP, la detección de PAFC y la toma np mediante microscopía de fluorescencia, lo que demuestra el potencial de este novedoso sistema para detectar CTCováles ováricos a concentraciones fisiológicamente relevantes.

La Figura 1A muestra una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas. El tamaño medio de la nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nm a 2,5 nm. La medición de nanopartículas se realizó en ImageJ. Se aplicaron funciones de umbral y cuenca hidrográfica para separar las partículas para la medición. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se midieron perpendiculares entre sí y se promediaron aún m...

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Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Se presenta un protocolo para detectar células tumorales ováricas circulantes utilizando un sistema de flujo fotoacústico hecho a medida y nanopartículas de sulfuro de cobre con ácido fólico dirigido.

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Las medidas de detección clínica de cáncer de ovario actuales son inespecíficas y carecen de detección de punto de atención de las células tumorales circulantes. Nuestro sistema de flujo fotoacústico permite analizar muestras de pacientes en busca de marcadores específicos de cáncer de ovario en el torrente sanguíneo. Este procedimiento proporciona una tecnología de plataforma única con mejoras sobre las técnicas actuales en términos de simplicidad, bajo costo, límites prometedores de detección y capacidad para ser aplicado a aplicaciones amplias.A través de este trabajo, nuestro objetivo es construir a partir de nuestro sistema de nanopartículas dirigido para el cáncer de ovario para probar muestras de pacientes ex vivo para los CTC. Este sistema PAFC altamente versátil es capaz de expandirse para uso clínico, probando la presencia de una amplia gama de biomarcadores en la sangre. La alineación óptica adecuada es fundamental para la detección de objetivos dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.Además, para garantizar un acoplamiento acústico adecuado, asegúrese de que no haya burbujas entre el portaobjetos de vidrio y el transductor. Debido a la naturaleza personalizada del sistema de flujo y sus componentes, la visualización del método es beneficiosa para una reproducción precisa. En una campana de humos química ventilada, filtre aproximadamente 300 mililitros de agua desionizada a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros.Agregue 0,0134 gramos de cloruro de cobre y 100 mililitros de agua desionizada a un matraz de fondo redondo limpio de 250 mililitros para crear una solución de cloruro de cobre de un milimolar. Añadir 0,015 gramos de ácido fólico al matraz y utilizar una barra de agitación magnética para mezclar la solución durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, mezcle 0,024 gramos de sulfuro de sodio nonahidrato con 100 microlitros de agua desionizada.Utilice una pipeta de 200 microlitios para añadir lentamente esta solución a la mezcla de reacción durante una duración de aproximadamente 10 segundos. Tapa la nave de reacción. Coloque el recipiente en un baño de aceite a 90 grados Centígrados y continúe revolviendo.Después de aproximadamente 15 minutos o cuando el baño de aceite ha alcanzado el rango de temperatura entre 85 y 90 grados Celsius, permita que la reacción continúe durante una hora adicional. Una vez completada la reacción, retire el recipiente de reacción del baño de aceite y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos antes de transferirlo a un baño de hielo. Una vez que la reacción se enfríe, ajuste el pH a aproximadamente 10 utilizando un hidróxido de sodio molar.Añadir la mezcla a una columna de centrifugación de 30 kilodalton en lotes de 15 mililitros y centrífuga a 3. 082 veces g durante 15 minutos para purificar la mezcla de reacción. En primer lugar, mezcle las nanopartículas de sulfuro de cobre tapadas con ácido fólico a la concentración adecuada en medios RPMI frescos. Añadir esta solución de nanopartículas a cada pozo de la placa de 24 pozos preparada que contiene células SK-OV-3 a una concentración de 400 microgramos por mililitro.Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de esto, tripsina las células con 0,5 mililitros de 0,25%trypsin y EDTA. Para neutralizar la tripina, agregue al menos un mililitro de RPMI 1640 sin ácido fólico y centrifugar las células a 123 veces g durante seis minutos.Para lavar las células, retire el sobrenadante, resuspender las células en dos mililitros de PBS y centrífuga a 123 veces g durante seis minutos. Repita este paso de lavado dos veces para eliminar las nanopartículas no enlazadas. Luego resuspendir las células con uno a dos mililitros de una solución de 2%Tween en PBS.Cuente las células usando un hemocicómetro y Trypan Blue. Diluir las células en una solución de 2%Tween en PBS a la concentración elegida para la detección. Utilice el archivo STL tridimensional proporcionado para imprimir en 3D el tanque de flujo con termoplástico ABS o plástico PLA.Después de imprimir el tanque, limpie y ensamble el sistema para su uso. Coloque los cubreobjetos de vidrio sobre la ranura de un milímetro por tres milímetros y el orificio de un centímetro en el sistema de flujo y selle cuidadosamente con silicona para evitar fugas. A continuación, coloque el tubo capilar en los tubos curados con silicona.Inserte los tubos en la cámara de flujo a través del lado del tanque de flujo de tal manera que el tubo capilar de vidrio esté directamente por encima y delante de la ranura de tres milímetros y el orificio de un centímetro. Selle el tubo con silicona. A continuación, conecte el transductor a un pulsador y receptor de ultrasonido.Amplifique la señal con una ganancia de decibelios 59. Conecte la salida del filtro a un osciloscopio reconfigurable multipropósitos equipado con una matriz de puertas programables de campo incorporada. Conecte uno de los tubos que vienen de la cámara de flujo a una unión T que está conectada a dos bombas de jeringa en cada rama.Llene una de las bombas de jeringa con aire y la otra bomba con la muestra a analizar. Ajuste la bomba que contiene aire a un caudal de 40 microlitros por minuto y ajuste la bomba que contiene la muestra a un caudal de 20 microlitros por minuto. A continuación, conecte el tubo restante que sale del sistema de flujo a un contenedor de 10% de lejía para eliminar las células después de salir del sistema de flujo.Coloque la sección del tubo capilar de cuarzo en alineación directa con el transductor en la vista de campo del microscopio para permitir una colocación cuidadosa de la fibra óptica por encima de la muestra de manera que ilumine toda la anchura del tubo. Irradiar la muestra utilizando una fibra óptica canalizando un láser de estado sólido bombeado por diodo que funciona a una longitud de onda de 1.053 nanómetros. Utilice una cámara montada en un microscopio para registrar el flujo, la cocción del láser y el paso de muestras a través del sistema de flujo.En este estudio, la citometría de flujo fotoacústico y el agente de orientación de sulfuro de cobre dirigido se utilizan para detectar células tumorales circulantes de ovario. Una imagen TEM típica de las nanopartículas sintetizadas muestra que el tamaño promedio de una nanopartícula típica es de aproximadamente 8,6 nanómetros. Los diámetros horizontales y verticales de cada partícula se miden perpendiculares entre sí y se promedian aún más.El diámetro hidrodinámico promedio de estas partículas es de 73,6 nanómetros. Las nanopartículas de sulfuro de cobre tienen una curva de absorbancia característica que se extiende hacia el infrarrojo cercano. Hay un ligero artefacto alrededor de 850 nanómetros que es causado por el cambio de láseres por el espectrofotómetro.Las imágenes de microscopía de fluorescencia de células incubadas con nanopartículas etiquetadas fluorescentemente muestran que la absorción de nanopartículas se puede visualizar por la presencia de fluorescencia a través de la célula. Las células no incubadas con nanopartículas no muestran señal fluorescente. La presencia de esta señal fluorescente indica la absorción exitosa de las partículas y su capacidad para ser detectadas en el sistema de flujo.Aquí se muestran ejemplos de señales típicas de adquisición de datos. Los datos sin procesar indican las diferencias de señal entre las células etiquetadas con nanopartículas nanopartículas, PBS y ácido fólico tapados con ácido fólico. Utilizando la vista de laboratorio personalizada y el software MATLAB, las reconstrucciones de imágenes se realizan de los controles positivos y negativos en tiempo real y después de la adquisición, respectivamente.Los envolventes individuales se convierten posteriormente en valores de píxel y se muestran como columnas independientes. Se producen diferencias claras en la señal fotoacústica entre PBS y las nanopartículas de sulfuro de cobre tapada con ácido fólico a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Durante este procedimiento, es fundamental alinear correctamente el transductor de ultrasonido, el microscopio y la fibra óptica dentro del sistema de citometría de flujo fotoacústico.Confirme la alineación del sistema probando controles positivos y negativos. Debido a la versatilidad de las técnicas de segmentación fotoacústica y a la amplia gama de aplicaciones posibles utilizando PAFC, esta técnica allana el camino para aplicaciones clínicas y de investigación traslacionalmente importantes. Para garantizar la aplicación clínica, se deben centrar más estudios en el análisis de muestras de pacientes y la reducción de los pasos procesales.La síntesis de las nanopartículas debe tener lugar en una campana de humo químico utilizando el equipo de protección adecuado. Las líneas celulares humanas deben manejarse de acuerdo con las directrices de su institución. El uso del láser requiere entrenamiento de seguridad radiológica y EPP adecuado.El uso de láser y las pruebas fotoacústicas solo deben ser realizadas por personal altamente capacitado.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

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Investigación

Bioingeniería

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