Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

ونود أن نشكر أعضاء مختبر مارتين - بلانكو على المناقشات المفيدة. كما نشكر Nic Tapon (معهد كريك، لندن، المملكة المتحدة)، ومركز بلومينغتون للأوراق المالية (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) وFlyBase (للشرح الجيني Drosophila). تم دعم فيديريكا مانجيون من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه من JAE-CSIC. تم تمويل مختبر مارتن بلانكو من Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P و BFU2017-82876-P) ومن Fundación Ramón Areces.

ملاحظة: ينقسم هذا البروتوكول إلى خمس خطوات: (1) إعداد الجرو، (2) إعداد الجرو للتصوير، (3) التصوير الحي لظهارة البطن المتنامية، (4) توليد الفسيفساء الوراثية، (5) معالجة البيانات وتحليلها (بما في ذلك أقسام تصف كيفية تحليل ديناميكيات اتجاه الخلية من الخطوط العريضة لتقاطع الخلايا وديناميكيات النمو...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

النظام بعيد المدى هو سمة أساسية لمعظم الوحدات الفسيولوجية الوظيفية. خلال تكوين الشكل ، يتم تحقيق النظام من خلال دمج التعليمات المعقدة التي يتم تنفيذها بدقة زمنية ومكانية عالية. يتم دمج القيود متعددة المستويات والمتعددة المستويات في ترتيبات الأنسجة النمطية.
القطبية والاتج...

لتحقيق أدوارها، الأنسجة الظهارية تعتمد بشكل كامل على التنظيم المكاني لمكوناتها الخلوية. في معظم النعوت، لا يتم تعبئة الخلايا ضد بعضها البعض فقط لإنشاء طبقة حصوية دقيقة ولكنها توجه نفسها نسبة إلى محاور الجسم.
الأهمية الوظيفية لتنظيم الأنسجة الدقيقة واضحة في الظهارة الحسية ، مثل الأذن الداخلية الفقارية وشبكية العين. في الحالة الأولى ، الشعر والخلايا الداعمة محاذاة في اتجاه محوري محدد لاستشعار كفاءة المدخلات الميكانيكية مثل الصوت والحركة1،2. وبالمثل، فإن التنظيم المكاني لخلية المستقبلالضوئي ضروري لتحقيق الخصائص البصرية المثلى من قبل شبكية العين3. وبالتالي فإن التحكم المكاني في موضع الخلية واتجاهها له أهمية خاصة بالنسبة للوظيفة الفسيولوجية المناسبة.
Drosophila هي حشرة ثلاثية الأبعاد تخضع لتحول كامل في هياكل جسم اليرقات من خلال التحول ، مما يؤدي إلى أنسجة البالغين. وpupa Drosophila هو نموذج ممتاز للتصوير الحي غير الغازية من مجموعة متنوعة من الأحداث الديناميكية، بما في ذلك هجرة الخلايا التنموية4،انقسام الخلية وديناميات النمو5،تقلص العضلات6،موت الخلية7،إصلاح الجرح8،واتجاه الخلية9. في دروسوفيلاالكبار ، يظهر الظهارة الخارجية درجة عالية من النظام. ويلاحظ هذا بسهولة على ترتيبات trichomes (أي نتوءات الخلايا الناشئة من الخلايا الظهارية واحدة) وشعيرات الحسية في جميع أنحاء سطح الجسم ذبابة10. في الواقع، يتم محاذاة trichomes في صفوف متوازية توجيه تدفق الهواء11. يبدأ تكوين الظهارة للبالغين والترتيب المنظم للخلايا الفردية أثناء تكوين الجنين ويتوج خلال مراحل الجرو. بينما في الأجنة أقسام الخلية، intercalations، وشكل التغييرات جميع انخفاض ترتيب الأنسجة12،13، وهذا هو عاد في مراحل لاحقة من التنمية ، وخاصة في مراحل الجرو ، عندما تقترب الذبابة النضج9.
يوفر جرو Drosophila غير المتنقل نظامًا مثاليًا لتقييم شكل الخلية وتغيرات الاتجاه. البشرة البطنية الجروية يقدم مزايا خاصة. في حين أن السلائف من رئيس الكبار، الصدر، الأعضاء التناسلية، والزوائد تنمو والحصول على منقوشة من مراحل اليرقات، والبلس، والتي يتم دمجها في البشرة اليرقات، تبدأ في النمو والتمييز فقط في pupariation14. تسمح هذه الميزة بتتبع جميع الأحداث الزمنية المكانية التي ينطوي عليها إنشاء ترتيب الأنسجة في مجملها9.
يتم تحديد البلس أثناء النمو الجنيني في المواقف المخالفة في كل جزء من أجزاء البطن المفترضة. البشرة البطنية الظهرية للبالغين مشتقة من أعشاش الهيستوبلاستقع الظهرية الموجودة في المقصورات الأمامية والخلفية15،16. كما توسع الهيستوبلاسس، واستبدال الخلايا الظهارية اليرقات (LECs)، والأعشاش الكونترافين الصمامات في خط الوسط الظهري تشكيل ورقة ملتوية17،18،19،20.
يصف هذا العمل 1) منهجية للتشريح، وتركيب، والتصوير الحي على المدى الطويل من الخوخ Drosophila، و 2) الطرق التحليلية لدراسة ديناميات التوجه الخلوي والنمو في دقة زمنية عالية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا ، يغطي جميع الخطوات المطلوبة من إعداد الخوخ الأولي (أي التدريج والتصوير) إلى استخراج وتقدير خصائص الاتجاه والتوجيه. كما أننا نصف كيفية استنتاج خصائص الأنسجة المحلية من تحليل استنساخ الخلايا. جميع الخطوات الموصوفة هي الحد الأدنى من الغازية وتسمح بإجراء تحليلات حية على المدى الطويل. يمكن تكييف الأساليب الموصوفة هنا بسهولة وتطبيقها على مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الكائنات الحية النموذجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

داخل الكائنات متعددة الخلايا ، والأنسجة الناضجة والأجهزة عرض درجات عالية من النظام في الترتيبات المكانية للخلايا المكونة لها. وهناك مثال رائع من النعت الحسي، حيث يتم جمع خلايا من نفس الهويات أو الهويات المتميزة معا عبر التصاق الخلية الخلية تظهر أنماط بلازار منظمة للغاية. الخلايا محاذاة إلى بعضها البعض في نفس الاتجاه وعرض قطبية مكافئة على مسافات كبيرة. يتم تأسيس هذه المنظمة من النعت ناضجة على مدى مورفوجينيسيس. لفهم كيفية تحقيق الترتيب البُلّي ّ للنعت الناضج ، من الأهمية بمكان تتبع اتجاه الخلية وديناميكيات النمو مع الإخلاص الصدغي العالي أثناء التطور في الجسم الحي. كما أن الأدوات التحليلية القوية ضرورية لتحديد وتوصيف التحولات المحلية إلى العالمية. وpupa Drosophila هو نظام مثالي لتقييم التغييرات شكل الخلية الموجهة الكامنة وراء مورثوجينيسيس الظهارية. تشكل ظهارة الظهارة النامية للظهارة السطح الخارجي للجسم غير المتنقل ، مما يسمح بالتصوير على المدى الطويل للحيوانات السليمة. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة البطنية الجروية أثناء نموها. يمكن تكييف المنهجية الموصوفة بسهولة مع تصوير سلوكيات الخلايا في مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الهياكل تحت الخلية أو الكائنات الحية النموذجية.

يغطي البروتوكول المذكور أعلاه إعداد الخوخ Drosophila للتصوير الحي على المدى الطويل وإجراءات تحليل اتجاه الخلية وديناميكيات نمو البشرة البطنية. من خلال تطبيق هذه المنهجية فمن الممكن لتوليد أفلام عالية الدقة من الخوخ النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض ضوئي كبير أو س?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

داخل الكائنات متعددة الخلايا، تعرض الأنسجة درجات عالية في اتجاهها المكاني. تحاذي الخلايا وتعرض مجموعة من الأولويات على مسافات كبيرة خلال فترة تكوين المورفين. لفهم كيفية التوصل إلى ترتيبات النوبة من الظهارة أثناء التطوير ، من المهم تتبع توجهات الخلية وديناميات النمو مع الإخلاص الزمني العالي في الجسم الحي.تم تصميم البروتوكول الموصوف لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة الدوزوفيلية. هذه المنهجية يمكن أن توفر رؤى في نظرية مختلفة من البحوث، وبيولوجيا الخلايا، وmorphogenesis، والاقطاب الملوحة ويمكن تطبيقها على تحليل الأنسجة الأخرى، والهياكل، والنماذج. يمكن تنفيذ جميع الخطوات بسهولة بعد بعض الممارسة.إنهم يطالبون بالدقة يساعد تصور هذا البروتوكول على تحقيق النتائج المثلى في وقت أقصر. تشريح الجرو معقد.للبدء، استخدم فرشاة طلاء مبللة لنقل أبيض ما قبل الخراب إلى قارورة بلاستيكية جديدة، والاحتفاظ بها هناك لطالما لزم الأمر في 25 درجة مئوية. ثم، إزالة كل خادر من جدار القارورة بمساعدة ملقط. الغراء الجانب البطني من كل pupa على شريحة زجاجية مغطاة شريط لاصق مزدوج من جانب.الاستفادة بلطف على سبيراكيليس الرأس والسطح الظهري من pupa مع نصائح من ملقط لضمان التصاق حالة pupal إلى الشريط. بدء تشريح تحت مجهر ستيريو عن طريق إزالة بلطف operculum من puparium مع ملقط. إدراج طرف واحد من ملقط في الضحلة بين حالة pupal وسطح pupa من خلال فتحopeular.المسيل للدموع القضية من الرأس إلى الذيل بشكل مؤقت في واحد أو أكثر من التقلبات، وتجنب معسر pupa. أضعاف مرة أخرى في حالة pupal متصدع إلى الجانبين الجانبي كما كنت الاستمرار في المضي قدما إلى الطرف الخلفي. إزالة pupa من حالة pupal فتحها عن طريق إدراج بعناية ملقط تحت الحيوان وسحب بلطف.الـ(خرا) يلتصق بطرف الـ(ملقط) عقد pupa بلطف من جانب البطن، ونقل الجراء إلى طبق الزجاج القاع على رأس قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون الغازية نفاذة. لفة قطعة من الورق المناديل الرطبة على حواف الطبق وتغطية الطبق للحفاظ على الرطوبة.توجيه pupa على قطرة النفط على الأطباق القاع الزجاج وفقا للمجال وعملية لتقييمها. للتصوير الحي على المدى الطويل من التوسع المبكر للعشاش الظهرية، الظهرالوجه الجانبي pupa. لتصوير توسعها المتأخر وإعادة عرض الأنسجة ، توجيه dorsally pupa.نقل الطبق الزجاجي السفلي الذي يحتوي على الجراء المثبتة إلى مرحلة المجهر والتركيز على سطح منطقة البطن باستخدام الضوء المنقول. لتوظيف إعادة التركيب الميتوتوتية للحث على الفسيفساء الوراثية في ظهارة البطن، وإعداد الإناث العذراء تحمل صدمة حرارية flipase غير قابل للانسداد، وموقع FRT في موقع الجينوم محددة، وعلامة خلوية التعرف على distals إلى موقع FRT. إعداد الذكور المتحولين الذين يحملون موقع FRT في الموقع الجينومي المكافئ.عبر عدة الإناث والذكور في نسبة ثلاثة إلى واحد في قارورة بلاستيكية في 25 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أيام. لتوليد استنساخ الجسم في الهيستوبلاست، إجراء علاج الصدمات الحرارية في المرحلة الثالثة اليرقات instar من ذرية الصليب عن طريق غمر قارورة بلاستيكية تحتوي على الحيوانات في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة. في برنامج J الصورة، استخدم وظيفة الإسقاط أقصى كثافة لحماية شرائح المكدس Z المكتسبة بواسطة المجهر confocal في 2D.الاعشاش لها شكل مميز يوجهها في نظام احداثي مُعَطّق في مقدمة إلى اليسار و دورسال إلى الأعلى. لتحقيق أفضل النتائج مع هذا التحليل، يجب الحصول على صورة الإدخال مع دقة عالية. للحصول على قيم التوجيه النوعي على حواف الخلايا المحلية، انقر على القائمة الإضافية واختر خيار التوزيع J الاتجاه.تعيين سيجما إطار جاوسي إلى بكسل واحد، spline مكعب إلى تدرج، الحد الأدنى من الاتساق إلى 20 في المئة، والحد الأدنى للطاقة إلى واحد في المئة. استخدم خيار مسح الألوان المكون الإضافي. تعيين تدرج إلى اتجاه، والتشبع إلى الاتساق، والسطوع لإدخال الصورة.هذه رموز لون اتجاه حافة الخلية نسبة إلى نظام إحداثيات لوح الألوان. بعد ذلك، ضمن القائمة الإضافية، استخدم خيار قياس الاتجاه J لتحديد الاتجاهات الخلوية والخلية الاتجاهية إلى محاذاة الخلية. توليد الصغيرة، والمناطق غير متداخلة المتاخمة من مصلحة الوزن الموحدة حول 20 ميكرومتر مرات 20 ميكرومتر داخل المنطقة التي تحتلها الهستوبلاست.يحسب المقياس الملح الاتجاه المحلي السائد والاتساق من ROIs. في هذه الدراسة ، والمنهجية المستخدمة قادرة على توليد أفلام عالية الدقة من pupae النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض صورة كبيرة أو سمية الصورة. أمثلة من استنساخ نوع البرية التي تميزت بغياب NLS RFP وبقع التوأم في 26 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر هنا.المستنسخين ممدودين على طول الحدود الجزية. التوأم استنساخ مرتبة في موازاة أو جنبا إلى جنب. يظهر مورفولوجيا استنساخ نوع البرية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل الجراء مورفولوجيا الحدود المعقدة في كلتا المرحلتين.المربع وخفقات المؤامرات للبارامترات الهندسية في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تظهر المنطقة متوسط والمحيط زيادة كبيرة في هذه النافذة الزمنية. وقد تم الحفاظ على توجه استنساخ خلال التوسع وإعادة عرض. المعلمات شكل في 26 ساعة و 47 ساعة بعد تشكيل puparium تشير إلى خشونة، استدارة ودائرية بالكاد تغيرت في استنساخ نوع البرية.تأكد من عدم إلحاق الضرر بـ pupa ، وإلا سيموت في غضون ساعات قليلة ، مما يؤثر على التصوير المباشر. ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام مُشفر أو أداة سارتوس. تجنبي أن تقرّص نفسك عند تشريحها.من خلال تطبيق هذه المنهجيات الممكنة لتوليد أفلام عالية الدقة لفترات طويلة باستخدام تقنيات مختلفة تخيل. التنسيق إلى أقراص الفوتون أو الغزل. ويمكن استخدام التحليل الكلوري لاستكشاف الاستجابات غير المستقلة نظراً لأن الخلايا العشوائية تسهل في تحديد المحادثات المتبادلة أو آليات الاتصال الخلوي.يمكن تكييف هذه الطرق بسهولة لدراسة مجموعة كاملة من الظواهر المورفوجينية، بما في ذلك تنسيق نمو البشرة والعضلات والعصبية أثناء التحول.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

إعداد وضع الأنسجة حاسة الشم الطرفية الجزيئية والتحليل المناعي في المورفولوجية

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...