Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmerne af martín-blanco-laboratoriet for nyttige drøftelser. Vi takker også Nic Tapon (The Crick Institute, London, UK), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) og FlyBase (for Drosophila genanmærkning). Federica Mangione blev støttet af et JAE-CSIC prædoc.stipendium. Martín-Blanco-laboratoriet blev finansieret af Laboratoriumet Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P og BFU2017-82876-P) og fra Fundación Ramón Areces.

BEMÆRK: Denne protokol er opdelt i fem trin: (1) iscenesættelse af pupper, (2) forberedelse af puppe til billeddannelse, (3) levende billeddannelse af den voksende abdominale epithelia, (4) generation af genetiske mosaikker, (5) databehandling og analyse (herunder sektioner, der beskriver, hvordan man analyserer celle orientering dynamik fra celle krydset skitserer og vækstdynamikker fra celle kloner).
1. Iscenesættelse af Drosophila pupper før billeddannelse
<ol><li>Kulturflue...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

Langtrækkende orden er en væsentlig egenskab ved de fleste funktionelle fysiologiske enheder. Under morfogenese opnås orden gennem integration af komplekse instruktioner implementeret med høj tidsmæssig og rumlig præcision. Flere og flere niveauer begrænser er integreret i stereotype væv arrangementer.
Polaritet og retningsbestemthed er afgørende for ordnet rumligt arrangement under udvikling. Polaritet indebærer symmetri bryde under udviklingen. Det er nødvendigt at opnå asymmetri...

For at opnå deres roller, epitelvæv fuldt ud stole på den rumlige organisering af deres cellulære komponenter. I de fleste epithelia, celler er ikke kun pakket mod hinanden for at skabe en præcis brosten lag, men de orientere sig i forhold til kroppen akser.
Den funktionelle betydning af præcise væv organisation er indlysende i sensorisk epithelia, såsom hvirveldyr indre øre og nethinden. I det første tilfælde justeres hår og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt at fornemme mekaniske indgange som lyd og bevægelse1,2. Tilsvarende fotoreceptor celle rumlige organisation er afgørende for at opnå optimale optiske egenskaber ved nethinden3. Rumlig kontrol af celleposition og -orientering er således af særlig relevans for korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila er en holometabolous insekt, der gennemgår en fuldstændig transformation af sine larve kropsstrukturer gennem metamorfose, hvilket giver anledning til sin voksne væv. Den Drosophila puppe er en glimrende model for noninvasive levende billeddannelse af en række dynamiske begivenheder, herunder udviklingsmæssige celle migration4,celledeling og vækstdynamik5, muskelsammentrækning6,celledød7,sår reparation8, og celle orientering9. I den voksne Drosophila, den eksterne epitel viser en høj grad af orden. Dette er let observeret på arrangementer af trichomes (dvs. celle fremspring stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske børster over hele fluens krop overflade10. Faktisk er trichomes justeret i parallelle rækker vejledende luftstrøm11. Morfogenesen af den voksne epithelia og den bestilte placering af de enkelte celler starter under embryogenese og kulminerer under pupal stadier. Mens celledelinger, interkaleringer og form ændrer alle fald i vævsretningen12,13,tilbageføres dette på senere udviklingsstadier, især på hvalpestadier , når fluen nærmer sig modenhed9.
Den immobile Drosophila puppe giver et ideelt system til at evaluere celle form og orientering ændringer. Den pupal abdominal epidermis præsenterer særlige fordele. Mens prækursorer af den voksne hoved, brystkasse, kønsorganer, og vedhæng vokse og få mønstret fra larve stadier, histoblaster, som er integreret i larve epidermis, begynde at vokse og differentiere kun ved pupariation14. Denne funktion gør det muligt at spore alle spatiotemporale hændelser, der er involveret i etableringen af vævsorden i sin helhed9.
Histoblaster er specificeret under embryonal udvikling på kontralaterale positioner i hver formodede abdominal segment. Den dorsale abdominale epidermis af den voksne stammer fra dorsolaterally placeret histoblast reder til stede på den forreste og bageste rum15,16. Som histoblaster udvide, udskiftning af larve epitelceller (LECs), de kontralaterale reder sikring på dorsale midterlinjen danner et sammenløb ark17,18,19,20.
Dette arbejde beskriver 1) en metode til dissektion, montering, og langsigtet levende billeddannelse af Drosophila puppe, og 2) analytiske metoder til at studere dynamikken i cellulære orientering og vækst ved høj spatiotemporal opløsning. Der findes her en detaljeret protokol, der dækker alle de trin, der kræves fra det første pupa-præparat (dvs. iscenesættelse og billeddannelse) til udvinding og kvantificering af retningsbestemthed og orienteringsfunktioner. Vi beskriver også, hvordan man udleder lokale vævsegenskaber fra analysen af cellekloner. Alle de beskrevne trin er minimalt invasive og tillader langsigtede liveanalyser. De metoder, der er beskrevet her, kan let tilpasses og anvendes på andre udviklingsstadier, væv eller modelorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

Inden for flercellede organismer udviser modne væv og organer høje grader i rækkefølge i de rumlige ordninger af deres bestanddele. Et bemærkelsesværdigt eksempel er givet ved sensorisk epithelia, hvor celler af samme eller forskellige identiteter samles via celle-celle vedhæftning viser velorganiseret planær mønstre. Celler justerer til hinanden i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store afstande. Denne organisation af den modne epithelia er etableret i løbet af morfogenese. For at forstå, hvordan den planar arrangement af den modne epithelia opnås, er det afgørende at spore celle orientering og vækst dynamik med høj spatiotemporal troskab under udvikling in vivo. Robuste analytiske værktøjer er også afgørende for at identificere og karakterisere lokale til globale overgange. Den Drosophila puppe er et ideelt system til at evaluere orienteret celle form ændringer underliggende epitel morfogenese. Den pupal udvikle epitel udgør den ydre overflade af immobile kroppen, så langsigtet billeddannelse af intakte dyr. Protokollen beskrevet her er designet til at billedet og analysere celle adfærd på både globalt og lokalt plan i pupal abdominal epidermis som det vokser. Den beskrevne metode kan let tilpasses til billeddannelse af celle adfærd på andre udviklingsstadier, væv, subcellulære strukturer, eller model organismer.

Den ovenfor beskrevne protokol omfatter forberedelse af Drosophila puppe til langsigtet levende billeddannelse og procedurerne for analyse af celleorientering og vækstdynamik af abdominal epidermis. Ved at anvende denne metode er det muligt at generere høj opløsning film af den udviklende puppe i perioder på op til 48 timer uden væsentlig fotobleaching eller fototoksicitet. Øjebliksbilleder af abdominal epidermis (f.eks. histoblaster og LECs) på forskellige tidspunkter og ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Denne protokol er designet til billeddannelse og analyse af dynamikken i celleorientering og vævsvækst i Drosophila abdominal epithelia som frugtfluen gennemgår metamorfose. Den metode, der er beskrevet her, kan anvendes til undersøgelse af forskellige udviklingsstadier, væv og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modelorganismer.

Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Inden for flercellede organismer viser væv høje grader yderligere i deres rumlige orientering. Celler justere og vise en række prioritet over store afstande i løbet af morfogenese. For at forstå, hvordan planar arrangementer af epithelia nås under udviklingen, er det afgørende at spore celle's orienteringer og vækstdynamik med høj spacial tidsmæssig troskab in vivo.Den beskrevne protokol er designet til at afbilde og analysere celleadfærd på globalt og lokalt plan i drosophila pupal epidermis. Denne metode kan give indsigt i forskellige teori om forskning, cellebiologi, morfogenese, og planar polaritet og kan anvendes til analyse af andre væv, strukturer og modeller. Alle trin kan udføres nemt efter nogle praksis.De kræver præcision. Visualisering af denne protokol hjælper med at opnå optimale resultater på kortere tid. Den pupal dissektion er kompleks.Til at begynde, bruge en fugtet pensel til at overføre iscenesat hvid pre-pupper til en frisk plast hætteglas, og holde dem der så længe det er nødvendigt ved 25 grader Celsius. Fjern derefter hver pupper fra væggen af hætteglasset ved hjælp af stævle. Lim den ventrale side af hver pupper på et glas dias dækket med dobbeltsidet tape.Tryk forsigtigt på hovedet spiracles og dorsale overflade af puppen med spidsen af de virbe at sikre vedhæftning af pupal sagen til båndet. Begynd dissektion under et stereomikroskop ved forsigtigt at fjerne operculum fra puparium med snævler. Indsæt en spids af snævlene i en lavvandet mellem pupal sagen og pupper overfladen gennem operkulær åbning.Riv sagen fra hoved til hale sideom side i en eller flere gynger, undgå klemme puppen. Fold tilbage krakket pupal sagen til laterale sider, som du holder fortsætter til den bageste ende. Fjern puppen fra den åbnede op pupal sagen ved omhyggeligt at indsætte snævle under dyret og forsigtigt trække op.Puppen klæber til spidsen af pincet. Hold puppen forsigtigt ved ventrale side, og overføre puppen til et glas bund fad på toppen af en lille dråbe gas-permeable halocarbon olie. Rul et stykke vådt silkepapir i skålens kanter og dæk skålen til for at opretholde fugten.Orient puppen over olien dråbe på glasbundet retter i henhold til domænet og den proces, der skal evalueres. For langsigtet levende billeddannelse af den tidlige udvidelse af dorsale reder, dorsal lateral orientere puppen. At billedet deres sene ekspansion og væv remodeling, dorsally orientere puppen.Overfør glasbundet skål, der indeholder den monterede pupper til mikroskopet fase og fokusere på overfladen af maveregionen ved hjælp af transmitteret lys. At anvende mitotisk rekombination til at fremkalde genetiske mosaikker i abdominal epitel, forberede jomfru hunner bærer en varmechok inducerende flipase, en FRT site på et bestemt genomisk sted, og en genkendelig cellulære markør distalt til FRT site. Forbered mutant hanner bærer en FRT sted på tilsvarende genomisk placering.Kryds flere hunner og hanner i en tre til en andel i et plastikhætteglas ved 25 grader Celsius i fire til fem dage. For at generere somatiske kloner i histoblasterne udføres varmechokbehandling på den tredje instar larve fase af korsets afkom ved at nedsænke plastikhætteglassene, der indeholder dyrene i et vandbad ved 37 grader Celsius i 45 minutter til en time. I billedet J software, bruge den maksimale intensitet projektion funktion til at beskytte Z stak skiver erhvervet af konfokal mikroskopi i 2D.Rederne har en karakteristisk form, der orienterer dem i et planar koordinatsystem foran venstre og dorsal til toppen. For at opnå optimale resultater med denne analyse skal inputbilledet anskaffes med høj opløsning. Hvis du vil hente kvalitative orienteringsværdier på lokale cellekanter, skal du klikke på plug-in-menuen og vælge fordelingen af retning J.Indstil det gaussiske vindue sigma til en pixel, kubisk spline til gradient, minimum sammenhængsgrad til 20 procent og minimum energi til én procent. Anvbet farveundersøgelsen mulighed for plug-in. Indstil farvetone til retning, mætning til sammenhæng og lysstyrke til inputbillede.Denne farve koder cellekantretninger i forhold til det anede planarkoordinatsystem. Derefter skal du bruge indstillingen Retning J-målretning under plug-in-menuen til at kvantificere celleretninger og retningscelle til cellejustering. Generer små, tilstødende ikke-overlappende regioner af interesse af ensartet vægt omkring 20 mikrometer gange 20 mikrometer i det område, der er besat af histoblaster.Presserende målpunkt beregner den dominerende lokale orientering og sammenhæng fra ROI'erne. I denne undersøgelse, den anvendte metode er i stand til at generere høj opløsning film af den udviklende pupper i perioder på op til 48 timer uden betydelig foto blegning eller foto toksicitet. Eksempler på vilde type kloner præget af fraværet af RFP NLS og deres dobbelte pletter på 26 timer efter puparium dannelse er vist her.Klonerne aflange langs segmenternes grænser. Twin kloner arrangeret parallelt eller i tandem. Morfologi af en vild type klon på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse viser komplekse grænse morfologi på begge stadier.Box og whisker plots for geometriske parametre på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse viser den gennemsnitlige område og omkreds steget betydeligt i denne tid vindue. Klonens orientering blev opretholdt under udvidelse og ombygning. Form parametre på 26 timer og 47 timer efter puparium dannelse angiver ruhed, rundhed og cirkularitet næppe ændret i den vilde type kloner.Sørg for ikke at beskadige puppen, ellers vil den dø inden for et par timer, hvilket påvirker levende billeddannelse. Denne protokol kræver ikke, at der anvendes sartuseragens eller -instrument. Undgå at klemme dig selv, når du dissekerer.Ved at anvende disse metoder muligt at generere høj opløsning film i lange perioder ved hjælp af forskellige forestille teknikker. Brænd til foton eller spinning diske. Chloral analyse kan anvendes til at udforske ikke-autonome reaktioner, da tilfældige celler lette i identifikationen af krydssamtaler eller cellekommunikationsmekanismer.Disse metoder kan let tilpasses til at studere en bred vifte af morfogenetiske fænomener, herunder koordinering af epidermal, muskuløs, og neuro udvikling under metamorfose.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analyse blodlegemer befolkninger i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder til billeddannelse intracellulære pH af follikel stamcelle afstamning i Live Drosophila æggestokkene væv

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Udarbejdelsen af perifere olfaktoriske væv for at udvikle molekylære og immunhistokemisk analyse i Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion af Drosophila puppe nethinden for immunhistokemi, vestlige analyse og RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...