Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Wij willen de leden van het laboratorium Martín-Blanco bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Nic Tapon (The Crick Institute, Londen, UK), het Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) en FlyBase (voor Drosophila gen annotatie). Federica Mangione werd ondersteund door een JAE-CSIC predoctorale fellowship. Het Laboratorium Martín-Blanco werd gefinancierd uit het Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P en BFU2017-82876-P) en van de Fundación Ramón Areces.

OPMERKING: Dit protocol is verdeeld in vijf stappen: (1) het ensceneren van de poppen, (2) het voorbereiden van de poppen voor beeldvorming, (3) live beeldvorming van de groeiende buikelia, (4) generatie van genetische mozaïeken, (5) gegevensverwerking en -analyse (inclusief secties die beschrijven hoe de celoriëntatiedynamiek te analyseren vanuit de contouren van de celverbinding en de groei van de groei van celklonen).
1. Enscenering van Drosophila pop voor beeldvorming
<ol><li>...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

De orde van de lange afstand is een essentieel kenmerk van de meeste functionele fysiologische eenheden. Tijdens morfogenese wordt de orde bereikt door de integratie van complexe instructies die met hoge temporele en ruimtelijke precisie worden uitgevoerd. Meerdere en multilevel beperkingen zijn geïntegreerd in gestereotypeerde weefsel regelingen.
Polariteit en directionaliteit zijn cruciaal voor de geordende ruimtelijke ordening tijdens de ontwikkeling. Polariteit impliceert symmetrie breken...

Om hun rol te bereiken, epitheelweefsels volledig vertrouwen op de ruimtelijke organisatie van hun cellulaire componenten. In de meeste epithelia, cellen zijn niet alleen verpakt tegen elkaar om een nauwkeurige kasseienlaag te creëren, maar ze oriënteren zich ten opzichte van het lichaam assen.
Het functionele belang van nauwkeurige weefselorganisatie is duidelijk in zintuiglijke epithelia, zoals het gewervelde binnenoor en het netvlies. In het eerste geval richten haar- en ondersteunende cellen zich in een specifieke axiale richting om mechanische ingangen zoals geluid en beweging1,2efficiënt te voelen . Op dezelfde manier is fotoreceptorcel ruimtelijke organisatie essentieel voor het bereiken van optimale optische eigenschappen door het netvlies3. Ruimtelijke controle van de celpositie en oriëntatie is dus van bijzonder belang voor een goede fysiologische functie.
Drosophila is een holometaboleus insect dat een volledige transformatie van zijn larve lichaamsstructuren ondergaat door middel van metamorfose, wat aanleiding geeft tot zijn volwassen weefsels. De Drosophila pop is een uitstekend model voor de niet-invasieve live beeldvorming van een verscheidenheid aan dynamische gebeurtenissen, waaronder ontwikkelingscelmigratie4,celdeling en groeidynamiek5, spiercontractie6, celdood7, wondherstel8en celoriëntatie9. In de volwassen Drosophilavertoont het externe epitheel een hoge mate van orde. Dit wordt gemakkelijk waargenomen op de regelingen van trichomen (d.w.z. celuitsteeksels afkomstig van enkele epitheelcellen) en sensorische haren over het hele lichaamsoppervlak van de vlieg10. Trichomen zijn namelijk uitgelijnd in parallelle rijen die de luchtstroom11begeleiden . De morfogenese van de volwassen epithelia en de geordende opstelling van de individuele cellen begint tijdens embryogenese en culmineert tijdens de popstadia. Terwijl in embryo's celdelingen, intercalaties en vormveranderingen alle afname weefselorde12,13, wordt dit in latere stadia van ontwikkeling, vooral in pupale stadia, wanneer de vlieg rijpheid9nadert .
De immobiele Drosophila pop biedt een ideaal systeem om veranderingen in de celvorm en oriëntatie te evalueren. De pop abdominale opperhuid biedt speciale voordelen. Terwijl de voorlopers van het volwassen hoofd, thorax, genitaliën en aanhangsels groeien en een patroon krijgen van larvestadia, beginnen de histoblasten, die zijn geïntegreerd in de larve opperhuid, te groeien en te differentiëren alleen bij pupariatie14. Deze functie maakt het mogelijk om alle spatiotemporale gebeurtenissen te volgen die betrokken zijn bij de vaststelling van weefselorde in zijn geheel9.
Histoblasten worden gespecificeerd tijdens de embryonale ontwikkeling op contralaterale posities in elk vermoedelijke buiksegment. De rugbuispieroppermis van de volwassene is afgeleid van dorsolateraal gelegen histoblast nesten aanwezig op de voorste en achterste compartimenten15,16. Terwijl histoblasten zich uitbreiden en de larve epitheelcellen (LECs) vervangen, smelten de contralaterale nesten samen op de dorsale middellijn die een samenvloeiend blad17,18,19,20vormt .
Dit werk beschrijft 1) een methodologie voor dissectie, montage, en lange termijn live beeldvorming van de Drosophila pop, en 2) analytische methoden om de dynamiek van cellulaire oriëntatie en groei te bestuderen bij hoge spatiotemporale resolutie. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt, dat alle stappen omvat die nodig zijn vanaf het eerste poppenpreparaat (d.w.z. enscenering en beeldvorming) tot de extractie en kwantificering van directionaliteit en oriëntatiekenmerken. We beschrijven ook hoe lokale weefseleigenschappen kunnen afleiden uit de analyse van celklonen. Alle beschreven stappen zijn minimaal invasief en maken live-analyses op lange termijn mogelijk. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast en toegepast op andere ontwikkelingsstadia, weefsels of modelorganismen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

Binnen meercellige organismen vertonen rijpe weefsels en organen een hoge mate van orde in de ruimtelijke ordening van hun samenstellende cellen. Een opmerkelijk voorbeeld wordt gegeven door zintuiglijke epithelia, waar cellen van dezelfde of verschillende identiteiten worden samengebracht via celcelhechting met zeer georganiseerde planaire patronen. Cellen uitlijnen op elkaar in dezelfde richting en tonen gelijkwaardige polariteit over grote afstanden. Deze organisatie van de rijpe epithelia wordt opgericht in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke opstelling van de volwassen epithelia wordt bereikt, is het cruciaal om celoriëntatie en groeidynamiek te volgen met een hoge spatiotemporale getrouwheid tijdens de ontwikkeling in vivo. Robuuste analytische instrumenten zijn ook essentieel om lokale-naar-wereldwijde overgangen te identificeren en te karakteriseren. De Drosophila pop is een ideaal systeem om georiënteerde celvormveranderingen te evalueren die ten grondslag liggen aan epitheelmorogenese. Het pupale ontwikkelende epitheel vormt het buitenoppervlak van het onbeweeglijke lichaam, waardoor op lange termijn beeldvorming van intacte dieren mogelijk is. Het hier beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op zowel mondiaal als lokaal niveau in de pop abdominale opperhuid te beeld en te analyseren terwijl het groeit. De beschreven methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan de beeldvorming van celgedrag in andere ontwikkelingsstadia, weefsels, subcellulaire structuren of modelorganismen.

Het hierboven beschreven protocol heeft betrekking op de bereiding van Drosophila-poppen voor langdurige live beeldvorming en de procedures voor de analyse van celoriëntatie en groeidynamiek van de buikopperken. Door het toepassen van deze methode is het mogelijk om hoge resolutie films van de zich ontwikkelende poppen te genereren voor perioden van maximaal 48 uur zonder significante fotobleaching of fototoxiciteit. Snapshots met de buikopperhuid (bijvoorbeeld histoblasten en L...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Binnen meercellige organismen, weefsel toont hoge graden verder in hun ruimtelijke oriëntatie. Cellen uitlijnen en tonen een bereik van prioriteit over grote afstanden in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke regelingen van epithelia wordt bereikt tijdens de ontwikkeling, is het cruciaal om de oriëntaties en groeidynamiek van de cel te volgen met een hoge ruimtelijke temporele getrouwheid in vivo.Het beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op globaal en lokaal niveau in de drosophila popdermis te beeld en analyseren. Deze methodologie kan inzicht geven in verschillende theorie van onderzoek, celbiologie, morfogenese en vlakke polariteit en kan worden toegepast op de analyse van andere weefsels, structuren en modellen. Alle stappen kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd na enige oefening.Ze eisen precisie. Visualisatie van dit protocol helpt bij het bereiken van optimale resultaten in een kortere tijd. De verpoppende dissectie is complex.Om te beginnen, gebruik een bevochtigde kwast om geënsceneerde witte pre-pop over te brengen naar een verse plastic flacon, en houd ze daar zo lang als nodig is bij 25 graden Celsius. Verwijder vervolgens elke pop van de wand van de flacon met behulp van tangen. Lijm de ventrale kant van elke pop op een glazen schuif bedekt met dubbelzijdige plakband.Tik voorzichtig op de hoofdspracles en het dorsale oppervlak van de pop met de uiteinden van de tangen om de hechting van de popgeval aan de tape te verzekeren. Begin dissectie onder een stereomicroscoop door het operculum voorzichtig uit het puparium te verwijderen met de tangen. Steek een puntje van de tangen in een ondiepe tussen de pop geval en de pop oppervlak door de opercular opening.Scheur de zaak van kop tot staart lateraal in een of meer schommels, het vermijden van knijpen de pop. Vouw de gebarsten popgeval terug aan de zijkanten terwijl je doorgaat naar het achterste uiteinde. Verwijder de pop uit de geopende pop geval door het voorzichtig invoegen van de tangen onder het dier en voorzichtig omhoog te trekken.De pop kleeft aan het puntje van de tangen. Houd de pop voorzichtig aan de ventrale kant, en breng de pop naar een glazen bodem schotel op de top van een kleine druppel gasdoorlatende halocarbon olie. Rol een stuk nat tissuepapier aan de randen van de schotel en bedek de schotel om de luchtvochtigheid te behouden.Oriënteer de pop over de oliedruppel op de glazen bodemschotels volgens het domein en het te evalueren proces. Voor lange termijn live beeldvorming van de vroege uitbreiding van de rugnesten, dorsale lateraal oriënteren van de pop. Om hun late expansie en weefsel remodelleren beeld, dorsaal oriënteren van de pop.Breng de glazen bodem schotel met de gemonteerde pop naar de microscoop stadium en focus op het oppervlak van de buikstreek met behulp van overgedragen licht. Om mitotische recombinatie in te zetten om genetische mozaïeken in het buikeptheel te induceren, bereiden maagdelijke vrouwtjes met een hitteshock induceerbare flipase, een FRT-locatie op een specifieke genomische locatie en een herkenbare cellulaire marker distaal naar de FRT-site. Bereid mutante mannetjes voor die een FRT-locatie dragen op de gelijkwaardige genomische locatie.Kruis verschillende vrouwtjes en mannetjes in een drie tot een verhouding in een plastic flacon op 25 graden Celsius voor vier tot vijf dagen. Om somatische klonen in de histoblasten te genereren, voert u een hitteschokbehandeling uit in het derde instar larvestadium van het nageslacht van het kruis door de plastic flacons met de dieren in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten tot een uur onder te dompelen. Gebruik in de image J-software de maximale intensiteitsprojectiefunctie om de Z-stacksegmenten te beschermen die zijn verworven door confocale microscopie in 2D.De nesten hebben een karakteristieke vorm die ze oriënteert in een vlakke coördinatensysteem voorste naar links en dorsale naar de top. Om met deze analyse optimale resultaten te bereiken, moet het invoerbeeld met hoge resolutie worden verkregen. Als u kwalitatieve oriëntatiewaarden wilt verkrijgen op lokale celranden, klikt u op het insteekmenu en kiest u de verdelingsoptie oriëntatie J.Stel de Gaussische venster sigma in op één pixel, kubieke spline op verloop, minimale samenhang op 20 procent en minimale energie op één procent. Gebruik de optie kleuronderzoek van de plug-in. Stel tint in op oriëntatie, verzadiging op samenhang en helderheid op invoerafbeelding.Deze kleur codeert celrandoriëntaties ten opzichte van het ingestelde vlakke coördinatensysteem. Gebruik vervolgens onder het insteekmenu de optie Oriëntatie J-maat om cellulaire oriëntaties en richtingscel te kwantificeren tot celuitlijning. Genereer kleine, aangrenzende niet-overlappende gebieden van belang van uniform gewicht ongeveer 20 micrometer keer 20 micrometer binnen het gebied bezet door de histoblasten.Met een persmaatregel wordt de dominante lokale oriëntatie en samenhang van de ROI's berekend. In deze studie, de gebruikte methode is in staat om hoge resolutie films van de ontwikkelende pop te genereren voor perioden van maximaal 48 uur zonder significante foto bleken of foto toxiciteit. Voorbeelden van wild type klonen gekenmerkt door de afwezigheid van RFP NLS en hun dubbele plekken op 26 uur na puparium vorming worden hier getoond.De klonen langwerpig langs de segmentale grenzen. Dubbele klonen gerangschikt in parallel of in tandem. Morfologie van een wild type kloon op 26 uur en 47 uur na puparium vorming toont complexe randmorfologie in beide stadia.Box en snorharen percelen voor geometrische parameters op 26 uur en 47 uur na puparium vorming tonen de gemiddelde gebied en omtrek aanzienlijk toegenomen in dit tijdvenster. De oriëntatie van de kloon werd gehandhaafd tijdens uitbreiding en remodellering. Vormparameters op 26 uur en 47 uur na de vorming van puparium geven aan dat de ruwheid, rondheid en circulariteit nauwelijks veranderd zijn in de wildtypeklonen.Zorg ervoor dat u de pop niet beschadigt, anders zal het binnen een paar uur sterven, wat de live beeldvorming beïnvloedt. Dit protocol vereist niet dat een sartus reagens of instrument wordt gebruikt. Vermijd knijpen jezelf bij het ontleden.Door het toepassen van deze methoden mogelijk om hoge resolutie films te genereren voor lange termijn periodes met behulp van verschillende imagine technieken. Brandpunt aan foton of spinnende schijven. Chlorale analyse kan worden gebruikt om niet-autonome reacties te onderzoeken, omdat willekeurige cellen vergemakkelijken bij de identificatie van kruisgesprekken of celcommunicatiemechanismen.Deze methoden kunnen gemakkelijk worden aangepast om een volledig scala van morfogenetische verschijnselen te bestuderen, met inbegrip van de coördinatie van epidermale, gespierde en neuro-ontwikkeling tijdens metamorfose.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-beeldvorming van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analyse van Actomyosin dynamiek op lokale cellulaire en weefsel schalen met behulp van timelapse-films van gekweekte Drosophila Eier kamers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissectie van de Drosophila pop netvlies voor Immunohistochemistry, westelijke analyse en RNA isolatie

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...