Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

ברצוני להודות לחברי מעבדת מרטין בלאנקו לדיונים מועילים. אנו מודים גם לניק טפפון (מכון קריק, לונדון, בריטניה), מרכז המניות של בלומינגטון (אוניברסיטת אינדיאנה, ארה ב) ו-FlyBase (עבור הביאור הגן של דרוזוהילה ). פדרצה נג נתמך על ידי מלגת מקדם-הדוקטורט ג'אי-CSIC. מעבדת מרטין-בלאנקו ממומנת מתוך הפרוגרמה האסטיילית מפואטדה (BFU2014-57019-P ו-BFU2017-82876-P) ומתוך מועצת הקסם רמון.

הערה: פרוטוקול זה מחולק לחמישה שלבים: (1) הכנת הגלמים, (2) להכין את הגלמים להדמיה, (3) הדמיה חיה של אפיליה הגוברת הבטן, (4) הדור של פסיפסים גנטיים, (5) עיבוד נתונים וניתוח (כולל סעיפים המתארים כיצד לנתח דינמיקה של כיוון התא מקווי המתאר
1 . היערכות הגלמים לפני הדמיה
<ol><li>התרבות זב?...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

הסדר הארוך טווח הוא מאפיין חיוני של היחידות הפיסיולוגיים התפקודית ביותר. במהלך הורפוגנזה, מושגת ההזמנה באמצעות שילוב של הוראות מורכבות המיושמת עם דיוק בזמן התיכון והמרחב. מגביל מרובה ומדורגת משולבים הסדרים רקמות סטריאומוקלדות.
קוטביות וכיווניות הינן קריטיות לסידור מרחבי...

כדי להשיג את תפקידם, רקמות אפיתל להסתמך באופן מלא על הארגון המרחבי של הרכיבים הסלולריים שלהם. ברוב epithelia, תאים הם לא רק ארוזים אחד נגד השני כדי ליצור שכבת האבנים מדויק, אבל הם האוריינט עצמם ביחס צירי הגוף.
החשיבות הפונקציונלית של ארגון הרקמה המדויקת ברורה באפיליה הסנסורית, כגון האוזן הפנימית של בעלי החוליות והרשתית. במקרה הראשון, השיער והתאים התומכים מתיישרים בכיוון צירית מסוים כדי לחוש ביעילות כניסות מכניות כגון קול ותנועה1,2. באופן דומה, גוף תא קולט אור הארגון המרחבי חיוני להשגת מאפיינים אופטיים אופטימליים על ידי הרשתית3. השליטה המרחבית של מיקום התא והתמצאות היא ובכך של רלוונטיות מיוחדת לתפקוד פיזיולוגי תקין.
דרוזופילה הוא חרק מholometabolous העובר טרנספורמציה מלאה של מבנה גוף הזחל שלה באמצעות מטמורפוזה, ומעורר את הרקמות הבוגרים שלה. הגולם הוא מודל מצוין עבור הדמיה חיה לא פולשנית של מגוון רחב של אירועים דינמיים, כולל הגירה תא התפתחותית4, מחלקת תאים ודינמיקה הצמיחה5, שריר התכווצות6, מוות התא7, פצע תיקון8, ותא כיוון9. בבית האדם המבוגר,האפיתל החיצוני מראה רמה גבוהה של הסדר. זה ניתן לצפות בקלות על הסדרים של trichomes (כלומר, בליטות תא שמקורם בתאים אפיתל יחיד) ו זיפים חושים בכל רחבי פני הגוף של הזבוב10. אכן, trichomes מיושרים בשורות מקבילות המנחה את זרימת אוויר11. הורפוגנזה של אפיתאליה למבוגרים וההסדר הסדור של התאים הבודדים מתחיל במהלך embryogenesis ולהגיע לשיאו במהלך שלבים גולמי. בעוד שבחטיבות תאים של העוברים, האינטרקלציות והצורה משנות את כל הסדר הקטן של הרקמה12,13, זה בחזרה בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח, במיוחד בשלבי גולמי, כאשר הזבוב מתקרב לבגרות9.
מערכת Drosophila מושלמת להערכת צורת תא והתמצאות. האפידרמיס הבטן גולמי מציג יתרונות מיוחדים. בעוד הסמנים של הראש המבוגר, בית החזה, אברי המין, ואת התוספות לצמוח ולקבל תבנית מתוך שלבי זחל, היסטריפיצוצים, אשר משולבים לתוך האפידרמיס זחל, להתחיל לצמוח ולהבדיל רק על הפפריציה14. תכונה זו מאפשרת מעקב אחר כל האירועים הטמפורלית המעורבים בהקמת סדר הרקמה בשלמותו9.
היסטלפיצוצים מצוינים במהלך התפתחות עובריים בתנוחות מושרות בכל פלח בטן שוערת. האפידרמיס הבטן האחורי של המבוגר נובע מdorsolaterally ממוקם קנים היסטורית להציג בתוך התאים הקדמי והאחוריים15,16. כמו מתרחבים היסטראקס, החלפת התאים האפיתל בזחל (lecs), מרעום הקנים הצלעות בלקו האמצע היוצר גיליון קונרהוט17,18,19,20.
עבודה זו מתארת 1) מתודולוגיה להדמיה, הרכבה והדמיה חיה ארוכת טווח של הגלמים של דרוזוהילה , ו -2 שיטות אנליטיות לחקר הדינמיקה של אוריינטציה תאית וצמיחה ברזולוציה גבוהה ביותר. פרוטוקול מפורט מסופק כאן, ומכסה את כל הצעדים הנדרשים מהכנת הגלמים הראשוניים (כלומר, היערכות והדמיה) להפקת וכימות של תכונות כיווניות וכיוון. אנו גם לתאר כיצד להסיק תכונות רקמה מקומית מניתוח של שיבוטים תא. כל השלבים המתוארים הם פולשניים מינימלית ומאפשרים ניתוחים לטווח ארוך. השיטות המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות וליישם בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, או אורגניזמים מודל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

בתוך אורגניזמים רב-תאיים, רקמות בוגרות ואיברים להציג דרגות גבוהות של סדר בהסדרים מרחביים של התאים המרכיבים שלהם. דוגמה יוצאת דופן ניתנת על ידי epithelia חושי, שבו תאים של זהות זהה או ברור מובאים באמצעות הדבקה תא תא מראה דפוסי מישורי מאורגן מאוד. תאים מתיישרים אחד לשני באותו כיוון ומציגים קוטביות שוות ערך על מרחקים גדולים. ארגון זה של אפיתאליה בוגרת מוקם במהלך הורפוגנזה. כדי להבין כיצד ההסדר מישורי של epithelia בוגרת מושגת, זה חיוני כדי לעקוב אחר כיוון התא ואת הדינמיקה הצמיחה עם נאמנות זמן זמני גבוהה במהלך הפיתוח ב vivo. כלים אנליטיים חזקים גם הם חיוניים כדי לזהות ולאפיין מעברים מקומיים לגלובליים. הגולם הוא מערכת אידיאלית להערכת צורה מכוונת של תאים שינויים בבסיס האפיתל. גולמי פיתוח אפיתל מהווה את המשטח החיצוני של הגוף משותק, המאפשר הדמיה ארוכת טווח של בעלי חיים שלמים. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לצלם ולנתח התנהגויות תא ברמות הכללית והמקומית באפידרמיס הבטן גולמי כפי שהוא גדל. המתודולוגיה תיאר ניתן להתאים בקלות הדמיה של התנהגויות תא בשלבים התפתחותיים אחרים, רקמות, מבנים subcellular, או מודל אורגניזמים.

הפרוטוקול המתואר לעיל מכסה את הכנת הגלמים של דרוזוהילה להדמיה ארוכת טווח והליכים לניתוח כיוון התאים והדינמיקה של האפידרמיס בבטן. על-ידי החלת מתודולוגיה זו ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 h ללא הלבנת שמות משמעותית או הרעלת תמונות. ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

בתוך אורגניזמים רב תאיים, רקמות מציגות מעלות גבוהות עוד יותר בכיוון המרחבי שלהן. תאים ליישר ולהציג טווח של עדיפות על פני מרחקים גדולים במהלך morphogenesis. כדי להבין כיצד הסידורים הפלינאריים של האפיתליה מושגים במהלך הפיתוח, חיוני לעקוב אחר כיווני התא ודינמיקת הצמיחה עם נאמנות זמנית ספיאלית גבוהה ב- vivo.הפרוטוקול המתואר נועד לדמיין ולנתח התנהגויות תאים ברמות גלובליות ומקומיות באפידרמיס הפופאלי drosophila. מתודולוגיה זו יכולה לספק תובנות על תיאוריה שונה של מחקר, ביולוגיה של התא, מורפוגנזה וקוטביות תכנן, ו ניתן ליישם אותה על ניתוח של רקמות, מבנים ומודלים אחרים. כל השלבים יכולים להתבצע בקלות לאחר תרגול כלשהו.הם דורשים דיוק. הדמיה של פרוטוקול זה מסייעת בהשגת תוצאות מיטביות בזמן קצר יותר. ניתוח הגוונים מורכב.כדי להתחיל, להשתמש במברשת צבע לחה להעביר מבוים לבן pre-pupae לבקבוקון פלסטיק טרי, ולשמור אותם שם כל עוד יש צורך ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר כל גלם מקיר הבקבוקון בעזרת מטלות. הדבק את הצד הגחוני של כל גולם על מגלשת זכוכית מכוסה בקלטת דביקה דו צדדית.הקש בעדינות על צריחי הראש ועל פני השטח הגביים של הגור עם קצות המדפים כדי להבטיח את הדבקה של מארז הגווע לקלטת. התחל לנתח תחת מיקרוסקופ סטריאו על ידי הסרת בעדינות את אופרקולום מן puparium עם המדפים. הכנס קצה אחד של המלקחים במארז רדוד בין המארז הגורי לבין משטח הגופה דרך פתח הניתוח.לקרוע את המקרה מכף אל זנב באופן משני בנדנדה אחת או יותר, הימנעות צביטת הגופה. מקפלים בחזרה את המקרה pupal סדוק לצדדים הצדדיים כפי שאתה ממשיך להמשיך עד הקצה האחורי. הסר את הגופה מן המקרה הגלוי נפתח על ידי החדרת בזהירות את המדפים מתחת לחיה בעדינות מושך למעלה.הגופה נדבקת לקצה המדפים. מחזיקים את הגלימה בעדינות בצד הגחוני, ומעבירים את הגופה לצלחת עם תחתית זכוכית על גבי טיפה קטנה של שמן הלוקרבון חדיר לגז. מגלגלים חתיכת נייר טישו רטוב בשולי המנה ומכסים את המנה כדי לשמור על לחות.לכוון את הגומד מעל טיפת השמן על המנות בתחתית הזכוכית על פי התחום ואת התהליך שיש להעריך. במשך זמן רב לחיות הדמיה של ההתפשטות המוקדמת של הקינים הגביים, הגבי לכוון את הגלם. כדי לדמיין את ההתפשטות המאוחרת שלהם ואת שיפוץ הרקמות, כוון את הגלמים.מעבירים את המנה עם תחתית הזכוכית המכילה את הגלמים הרכובים לשלב המיקרוסקופ ומתמקדים על פני השטח של אזור הבטן באמצעות אור משודר. כדי להשתמש recombination mitotic כדי לגרום פסיפסים גנטיים באפיתל הבטן, להכין נקבות בתולה נושאת flipase הלם חום בלתי ניתן לעיכול, אתר FRT במיקום גנומי מסוים, ו דיסטל סמן הסלולר לזיהוי לאתר FRT. הכינו זכרים מוטנטים הנושאים אתר FRT במיקום הגנומי המקביל.חוצים כמה נקבות וזכרים בפרופורציה אחת עד שלוש בבקבוקון פלסטיק ב 25 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד חמישה ימים. כדי ליצור שיבוטים סומטיים בהיסטובלסטים, בצע טיפול בהלם חום בשלב הזחל השלישי של צאצאי הצלב על ידי טביעה של בקבוקוני הפלסטיק המכילים את בעלי החיים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עד שעה. בתוכנת התמונה J, השתמש בפונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית כדי להגן על פרוסות מחסנית Z שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ קונפוקל ב- 2D.לקנים צורה אופיינית שמכווןת אותם במערכת קואורדינטות פלנארית לפנים שמאלה ודורסל למעלה. כדי להשיג תוצאות מיטביות עם ניתוח זה, יש לרכוש את תמונת הקלט ברזולוציה גבוהה. כדי להשיג ערכי כיוון איכותיים בקצוות תאים מקומיים, לחץ על תפריט התוסף ובחר באפשרות התפלגות J בכיוון.הגדר את סיגמא החלון הגאוסיאני לפיקסל אחד, spline מעוקב למילוי הדרגתי, קוהרנטיות מינימלית ל- 20 אחוזים ואנרגיה מינימלית לאחוז אחד. השתמש באפשרות סקר הצבעים של התוסף. הגדר את הגוון לכיוון, לרוויה לקוהרנטיות ולבהירות כדי להזין תמונה.צבע זה מקודדים כיוון קצה תא יחסית למערכת הקואורדינטות התבלתי-תכולה. לאחר מכן, תחת תפריט התוסף, השתמש באפשרות מדידת J בכיוון כדי לכמת כיוונים סלולריים ותא כיווני ליישור תאים. צור אזורים קטנים, סמוכים שאינם חופפים של עניין במשקל אחיד סביב 20 מיקרומטר פעמים 20 מיקרומטר בתוך האזור שנכבש על ידי ההיסטובלסטים.מדידה לוחצת מחשבת את הכיוון המקומי הדומיננטי ואת הקוהרנטיות של ה- ROIs. במחקר זה, המתודולוגיה המשמשת מסוגלת ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 שעות ללא הלבנת תמונות משמעותית או רעילות תמונה. דוגמאות של שיבוטים מסוג פראי המסומנים על ידי היעדר RFP NLS ואת כתמים התאומים שלהם ב 26 שעות לאחר היווצרות puparium מוצגים כאן.השיבוטים התארכמו לאורך גבולות המקטעים. שיבוטים תאומים מסודרים במקביל או במקביל. מורפולוגיה של שיבוט מסוג פראי ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות פופאריום מראה מורפולוגיה גבול מורכבת בשני השלבים.חלקות קופסה ושפם עבור פרמטרים גיאומטריים ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium להראות את השטח הממוצע ואת ההיקף גדל באופן משמעותי בחלון זמן זה. כיוון השיבוט נמשך במהלך התרחבות ושיפוץ. פרמטרי צורה ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium מצביעים על חספוס, מעוגל ועגול בקושי השתנה שיבוטים סוג פראי.הקפד לא לפגוע בגלם, אחרת הוא ימות תוך כמה שעות, וישפיע על ההדמיה החיה. פרוטוקול זה אינו דורש להשתמש בריג'נט או בכלי סרקטוס. הימנע צובט את עצמך בעת לנתח.על ידי יישום מתודולוגיות אלה ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה לתקופות ארוכות באמצעות טכניקות לדמיין שונים. מוקד לדיסקים פוטון או ספינינג. ניתוח כלורל יכול להיות מועסק כדי לחקור תגובות לא אוטונומיות מאז תאים אקראיים להקל בזיהוי של שיחות צולבת או מנגנוני תקשורת סלולרית.ניתן להתאים שיטות אלה בקלות לחקר מגוון רחב של תופעות מורפגנטיות, כולל תיאום של התפתחות אפידרמיס, שרירים ונוירו במהלך מטמורפוזה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...