Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

マルティン・ブランコ研究所のメンバーに感謝申し上げられる。また、ニック・タポン(英国ロンドン・クリック研究所)、ブルーミントン・ストック・センター(米国インディアナ大学)、FlyBase(ショウジョウバエ遺伝子注釈用)にも感謝します。フェデリカ・マンジョーネはJAE-CSICの博士研究員によって支えられました。マルティン・ブランコ研究所は、プログラム・エスタタル・デ・フォメント・デ・ラ・インベスティガシオン・シエンティフィカ・イ・テクニカ・デ・エクセレンシア(BFU2014-57019-PおよびBFU2017-82876-P)とフンダシオン・ラモン・アレススから資金提供を受けました。

注:このプロトコルは、(1)子犬をステージングし、(2)イメージングのための子犬を準備し、(3)成長する腹部上皮のライブイメージング、(4)遺伝的モザイクの生成、(5)データ処理および分析(細胞接合の概要および細胞クローンからの成長ダイナミクスからのダイナミクスと成長ダイナミクスから細胞の配向を分析する方法を説明するセクションを含む)に分けられる。
1. イメ?...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

長距離オーダーは、ほとんどの機能生理学的単位の必須特性である。形態形成の間、秩序は高い時間的および空間的精密と実施される複雑な命令の統合によって達成される。複数および多レベルの制約は、ステレオタイプ組織の配置に統合されています。
開発時の秩序空間配置には極性と方向性が重要です。極性は、発達中の対称性の破断を意味します。非対称性の達?...

その役割を達成するために、上皮組織は細胞成分の空間的組織に完全に依存している。ほとんどの上皮では、細胞は正確な石畳層を作り出すために互いに詰め合われているだけでなく、身体の軸に対して自分自身を向いています。
正確な組織組織の機能的重要性は、脊椎動物の内耳や陰部などの感覚上皮において明らかである。最初のケースでは、ヘアセルと支持セルは特定の軸方向に整列し、音や動き11、22などの機械的入力を効率的に感知します。同様に、感光体細胞空間組織は、レチナ3による最適な光学特性を達成するために不可欠である。細胞の位置と向きの空間的制御は、したがって、適切な生理機能のための特に関連性のである。
ショウジョウバエは、変態を通じて幼虫の体構造の完全な変換を受け、その成体組織を生み出す正形虫である。ショウジョウバエプは、発達細胞遊走4、細胞分裂および成長ダイナミクス5、筋収縮6、細胞死7、創傷修復8、および細胞配向9を含む様々な動的事象の非侵襲的なライブイメージングのための優れたモデルである。成体ショウジョウバエでは、外的上皮は高度な秩序を示す。これは、毛状突起(すなわち、単一の上皮細胞から生じる細胞突起)およびハエの体表面10の上の感覚毛の配置に容易に観察される。実際、毛状突起は、空気流11を導く平行な行に整列されている。成体上皮の形態形成と個々の細胞の秩序ある配置は、胚発生の間に始まり、プパル段階で最高潮に達する。胚細胞分裂、インターカレーション、および形状変化はすべて組織オーダー12、13を減少させるが、13これは発達の後期段階で、特に子犬の段階では、フライが成熟期9に近づくと戻される。
不移動性ショウジョウバの子犬は、細胞の形状および向きの変化を評価するのに理想的なシステムを提供する。パパル腹部表皮は特別な利点を提示する。成人頭部、胸郭、生殖器、および付属物の前駆体が成長し、幼虫段階からパターン化される一方で、幼虫表皮に統合されたヒストラストは、子犬14時にのみ成長し、分化し始める。この機能は、組織の秩序の確立に関与するすべての時空間的事象を完全に追跡することを可能にする 9.
ヒストブラストは、各推定腹部セグメントの対側位置で胚発生中に指定される。成人の背部腹部表皮は、前部および後部区画15,16,16に存在する背部位置ヒストブラスト巣に由来する。ヒスト芽細胞が拡大するにつれて、幼虫上皮細胞(LED)を置き換えると、反側の巣は、コンフルエントシート17、18、19、20,19,を形成する背側中線で融合する。17,20
この研究は、1)ショウジョウバエの解剖、取り付け、および長期ライブイメージングのための方法論、および2)高い時空間分解能における細胞の向きおよび成長のダイナミクスを研究する分析方法を説明する。ここでは、初期の子犬の準備(すなわち、ステージングおよびイメージング)から方向性および方向の特徴の抽出および定量化に必要なすべてのステップをカバーする詳細なプロトコルが提供されています。また、細胞クローンの解析から局所組織特性を推測する方法についても述べている。記載されているすべてのステップは、最小限の侵襲的であり、長期的なライブ分析を可能にします。ここで説明する方法は、容易に適応し、他の発達段階、組織、またはモデル生物に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

多細胞生物の中では、成熟した組織や器官は、その構成細胞の空間的配置において高い秩序を示す。顕著な例は、同一または異なる同一の同一のアイデンティティの細胞が非常に組織化された平面パターンを示す細胞細胞接着を介して一緒に持ち込まれる感覚上皮によって与えられる。セルは互いに同じ方向に整列し、大きな距離で同等の極性を表示します。成熟した上皮のこの組織は、形態形成の過程で確立される。成熟した上皮の平面配置がどのように達成されるのかを理解するためには、生体内での発達中に高い時空間的忠実度を持つ細胞の配向と成長ダイナミクスを追跡することが重要である。また、ローカルからグローバルへの移行を特定して特徴付けるためには、堅牢な分析ツールも不可欠です。ショウジョウバエウは、上皮形態形成の根底にある配向細胞形状の変化を評価するのに理想的なシステムである。上皮を発達するプパルは、不移動体の外部表面を構成し、無傷の動物の長期イメージングを可能にする。ここで説明するプロトコルは、成長するに従って、プパル腹部表皮のグローバルレベルと局所レベルの両方で細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。記載された方法論は、他の発達段階、組織、細胞内構造、またはモデル生物における細胞行動のイメージングに容易に適応することができる。

上述のプロトコルは、長期のライブイメージングのためのショウジョウバエの調製と、腹部表皮の細胞オリエンテーションおよび成長ダイナミクスの分析手順をカバーする。この方法論を適用することにより、著しい光漂白や光毒性を伴わない最大48時間の開発中の子犬の高解像度ムービーを生成することが可能です。異なる時点での腹部表皮(例えば、ヒスト?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

多細胞生物の中では、組織は空間配向でさらに高い度数を表示します。細胞は、形態形成の過程で大きな距離よりも優先順位の範囲を整列し、表示します。開発中に上皮の平面的な配置がどのように到達するかを理解するには、生体内で高い容量時間忠実度を持つ細胞の向きと成長ダイナミクスを追跡することが重要です。記載されたプロトコルは、ショウジョウバエプパル表皮のグローバルおよび局所レベルで細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。この方法論は、研究、細胞生物学、形態形成、平面極性の異なる理論に関する洞察を提供し、他の組織、構造、およびモデルの分析に適用することができる。すべてのステップは、いくつかの練習の後に簡単に実行することができます。彼らは精度を要求します。このプロトコルの可視化は、より短い時間で最適な結果を達成するのに役立ちます。パパル解離は複雑です。まず、湿らせた絵筆を使用して、段階的な白いプレパエを新鮮なプラスチックバイアルに移し、必要な限り摂氏25度でそこに保管してください。次に、鉗子の助けを借りてバイアルの壁から各子犬を取り除きます。両面付き粘着テープで覆われたガラススライドに、各子犬の腹側を接着します。頭の尖塔と子犬の後ろ面を鉗子の先端で静かにタップして、パパルケースのテープへの接着を保証します。鉗子で子犬からオペルキュラムを静かに取り除くことによって、ステレオ顕微鏡の下で解剖を開始します。口の開き口を通して、パパルケースと子犬の表面の間の浅い部分に鉗子の1つの先端を挿入する。1つ以上のスイングで頭から尾までケースを引き裂き、子犬をつまむのを避けます。後端に進み続ける際に、ひび割れたプパルケースを側面に折り返します。慎重に動物の下に鉗子を挿入し、穏やかに引き上げて、開いたプパルケースから子犬を取り除きます。子犬は鉗子の先端にくっつきます。腹側で子犬をそっと持ち、ガス透過性ハロカーボンオイルの小さな滴の上にガラス底の皿に子犬を移します。皿の端に濡れたティッシュペーパーを転がし、湿気を維持するために皿を覆う。ドメインと評価されるプロセスに応じて、ガラス底の皿の油滴の上に子犬を向けます。長期のライブ撮像のために、後ろ座の巣の早期拡張のために、後方は、横方向の子犬。彼らの後期膨張および組織の改造をイメージするために、ふけり状に子犬を向ける。取り付けられた子犬を含むガラス底皿を顕微鏡ステージに移し、透過光を使用して腹部の表面に焦点を合わせます。腹部上皮に遺伝的モザイクを誘導するために有糸組換えを採用するために、熱ショック誘導性フリパーゼを運ぶ処女女性、特定のゲノム位置のFRT部位、およびFRT部位に遠位する認識可能な細胞マーカーを調製する。FRT部位を同じゲノム位置に運ぶ変異体雄を準備する。25°Cのプラスチックバイアルで3~1の割合で、いくつかの女性と男性を4〜5日間交差させます。体細胞のクローンをヒストラストで生成するには、動物を含むプラスチックバイアルを水浴中に45分~1時間水浴に浸すことによって、十字架の前立腺の第3のインスター幼虫段階で熱ショック処理を行う。イメージJソフトウェアでは、最大強度投影関数を使用して、2Dで共焦点顕微鏡で取得したZスタックスライスを保護します。巣は、平面座標系の前から左に向き、最上部に後ろ向きに配置する特徴的な形状を持っています。この解析で最適な結果を得るには、入力画像を高解像度で取得する必要があります。ローカルセルのエッジで定性的な方向の値を取得するには、プラグインメニューをクリックし、方向 J 分布オプションを選択します。ガウス窓のシグマを 1 ピクセルに、3 次スプラインを勾配に、最小コヘレンシーを 20% に設定し、最小エネルギーを 1% に設定します。プラグインのカラー調査オプションを使用します。色相を向き、彩度を一貫性に、明るさを入力画像に設定します。この色は、設定された平面座標系に対するセルエッジの方向を符号化します。次に、プラグインメニューの配向 J メジャーオプションを使用して、セルラーの向きを数値化し、セル間の方向をセルに合わせます。ヒストブラストが占める領域内で20マイクロメートルの周りに20マイクロメートルの周りの均一な重量の関心の小さな、隣接しない非重なり領域を生成します。押し付けメジャーは、ROI から優勢なローカル方向と一貫性を計算します。本研究では、使用される方法論は、著しい写真の漂白または光毒性なしに最大48時間の発達中の子犬の高解像度映画を生成することができる。ここでは、puparium形成後26時間にRFP NLSとその双子のスポットが存在しない場合に特徴付けられた野生型クローンの例を示す。クローンは、セグメントの境界に沿って細長く表示されます。双クローンは並列または並行して配置される。26時間および47時間後の野生型クローンの形態は、両方の段階で複雑な境界形態を示す。子犬の形成後26時間47時間の幾何学的パラメータの箱とひげ図は、この時間枠で有意に増加した平均面積と周囲を示しています。クローンのオリエンテーションは、拡張と改造の間に維持されました。26時間および47時間後の形成パラメータは、野生型クローンでほとんど変化しない粗さ、丸みおよび円形を示す。子犬を損傷しないようにしてください、そうでなければ、それはライブイメージングに影響を与え、数時間以内に死ぬでしょう。このプロトコルは、サルタス試薬や器具を使用する必要はありません。解剖時に自分をつまむのは避けてください。これらの方法論を応用することで、異なる想像技術を用いて長期間の高解像度ムービーを生成することが可能である。フォトンまたは回転するディスクへの焦点。ランダムセルはクロストークや細胞通信機構の同定を容易にするため、クロラル分析を用い、非自律応答を探索することができます。これらの方法は、変態中の表皮、筋肉、および神経発達の調整を含む形態遺伝学的現象の全範囲を研究するために容易に適応することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...