Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

우리는 도움이 토론에 대한 마틴 - 블랑코 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 닉 타폰 (크릭 연구소, 런던, 영국), 블루밍턴 스톡 센터 (인디애나 대학, 미국) 및 FlyBase (초파리 유전자 별표)에 감사드립니다. 페데리카 만지오네는 JAE-CSIC 박사 전 펠로우십의 지원을 받았습니다. 마르틴-블랑코 연구소는 프로그램 아토타 에스타탈 드 포멘토 드 라 인베스티가시온 Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P 및 BFU2017-82876-P)와 Fundación 라몬 아레세스로부터 자금을 지원받았습니다.

참고 : 이 프로토콜은 다섯 단계로 나뉩니다 : (1) 번데기, (2) 이미징을위한 번데기를 준비하고, (3) 성장하는 복부 상피의 라이브 이미징, (4) 유전 모자이크의 생성, (5) 데이터 처리 및 분석 (세포 접합 윤곽선및 세포 클론에서 성장 역학에서 세포 배향 역학을 분석하는 방법을 설명하는 섹션 포함).
1. 화상 진찰의 앞에 초파리 pupae의 발판
<ol><li>배양은 계란 누워 후 5 일 ...

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장거리 주문은 대부분의 기능성 생리학적 단위의 필수 특성입니다. 형태 형성 동안, 순서는 높은 시간 및 공간 정밀도로 구현 된 복잡한 명령의 통합을 통해 달성된다. 다중 및 다단계 구속은 스테레오타입 조직 배열로 통합됩니다.
극성과 지향성은 개발 중에 정렬된 공간 배열에 매우 중요합니다. 극성은 개발 중에 대칭 파괴를 의미합니다. 비대칭의 성취는 배아 전방 후방 (A...

그들의 역할을 달성하기 위해 상피 조직은 세포 구성 요소의 공간 조직에 완전히 의존합니다. 대부분의 에피텔리아에서 세포는 정확한 조약돌 층을 만들기 위해 서로 에피테일뿐만 아니라 신체 축을 기준으로 방향을 조정합니다.
정확한 조직 조직의 기능적 중요성은 척추 동물 내이및 망막과 같은 감각 상피에서 명백합니다. 첫 번째 경우, 머리카락과 지지 셀은 특정 축 방향으로 정렬되어 소리 및 동작1,,2와같은 기계적 입력을 효율적으로 감지합니다. 유사하게, 광수용체 세포 공간 조직은 망막3에의해 최적의 광학 적 특성을 달성하기 위해 필수적이다. 세포 위치 및 방향의 공간 제어는 따라서 적절한 생리 기능에 대한 특정 관련성이다.
Drosophila는 변형을 통해 애벌레 신체 구조의 완전한 변형을 겪는 홀로 메타 볼곤충으로 성인 조직을 초래합니다. Drosophila pupa는 발달 세포 이동4,세포 분열 및 성장 역학5,근육 수축6,세포 사멸7,상처 수리8,세포 방향9등 다양한 동적 사건의 비침습적 라이브 이미징을 위한 우수한 모델이다. 성인 초파리에서외부 상피는 높은 수준의 질서를 보여줍니다. 이것은 쉽게 상피 (즉, 단일 상피 세포에서 유래 세포 돌출)와 비행의 신체 표면(10)에걸쳐 감각 강모의 배열에 관찰된다. 실제로, 허집은 공기 흐름을 안내 병렬 행에정렬된다 11. 성인 에피탈리아의 형태 형성과 개별 세포의 정렬 된 배열은 배아 발생 중에 시작되고 pupal 단계 동안 절정을 이룬다. 배아 세포 분열에서, intercalations 및 모양은 모두 감소 조직 순서12,,13,이것은 개발의 나중 단계에서, 특히 푸팔 단계에서, 비행이 성숙에 접근할 때9.
움직이지 않는 초파리 퍼프는 세포 모양과 배향 변화를 평가하는 이상적인 시스템을 제공합니다. pupal 복부 표피는 특별한 이점을 제시합니다. 성인 머리, 흉부, 생식기 및 부속기의 전구체가 자라고 애벌레 단계에서 패턴화되는 동안, 애벌레 표피에 통합된 히스토블라스트는14번에서만 성장하고 분화하기 시작한다. 이 기능은 전체9에서조직 질서의 확립에 관련된 모든 시공간적 사건을 추적 할 수 있습니다.
조직 폭발은 각 추정 복부 세그먼트에 있는 반대 측 위치에 배아 발달 도중 지정됩니다. 성인의 등쪽 복부 표피는 전방 및 후방 구획에 존재하는 등측에 위치한 히스토블라스트둥지로부터 유래15,,16. 히스토블라스트가 팽창함에 따라, 애벌레 상피 세포(LECs)를 대체하며, 상반된 둥지는 등쪽 중간선에서 융합되어17,,18,,19,,20을형성한다.
이 작품은 1) Drosophila pupae의 해부, 장착 및 장기 라이브 이미징을위한 방법론, 2) 높은 주분체 해상도에서 세포 배향 및 성장의 역학을 연구하는 분석 방법을 설명합니다. 상세한 프로토콜은 초기 pupae 준비 (즉, 준비 및 이미징)에서 방향성 및 방향 기능의 추출 및 정량화에 필요한 모든 단계를 포함하는 여기에 제공됩니다. 우리는 또한 세포 클론의 분석에서 국소 조직 특성을 추론하는 방법을 설명합니다. 설명된 모든 단계는 최소 침습적이며 장기 적인 라이브 분석을 허용합니다. 여기에 설명된 방법은 다른 발달 단계, 조직 또는 모델 유기체에 쉽게 적응하고 적용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

다세포 유기체 내에서, 성숙한 조직 및 기관은 그들의 구성 세포의 공간 배열에 순서의 높은 학위를 표시합니다. 놀라운 예는 동일하거나 명백한 정체성의 세포가 고도로 조직된 평면 패턴을 보여주는 세포 세포 접착을 통해 함께 모이는 감각 에피텔리아에 의해 주어집니다. 셀은 동일한 방향으로 서로 정렬하고 큰 거리에서 동등한 극성을 표시합니다. 성숙한 상피의이 조직은 형태 형성의 과정을 통해 확립됩니다. 성숙한 상피의 평면 배열이 달성되는 방법을 이해하기 위하여는, 생체 내에서 발달 도중 높은 주시부 충실도를 가진 세포 배향 그리고 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다. 또한 로컬-글로벌 전환을 식별하고 특성화하는 데 강력한 분석 도구도 필수적입니다. Drosophila pupa는 상피 형태 형성의 근본적인 지향성 세포 모양 변경을 평가하는 이상적인 시스템입니다. pupal 개발 상피는 움직이지 않는 바디의 외부 표면을 구성합니다, 손상되지 않은 동물의 장기 적인 화상 진찰을 허용하. 여기에서 기술된 프로토콜은 퍼팔 복부 표피에 있는 글로벌 그리고 현지 수준 둘 다에 있는 세포 행동을 심상하고 분석하기 위하여 디자인됩니다. 기술된 방법론은 그밖 발달 단계, 조직, 세포이하 구조물, 또는 모형 유기체에 세포 행동의 화상 진찰에 쉽게 적응될 수 있습니다.

위에서 설명한 프로토콜은 장기 라이브 이미징을 위한 Drosophila pupae의 준비와 복부 표피의 세포 배향 및 성장 역학의 분석을 위한 절차를 다룹니다. 이 방법론을 적용함으로써 유의한 광표백 또는 광독성 없이 최대 48시간 동안 개발 된 번데의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. 상이한 시점과 다른 각도에서 배반되는 번데기에서 복부 표피(예를 들어, 히스토블?...

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Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

다세포 유기체 내에서 조직은 공간 방향에서 높은 정도를 더 표시합니다. 세포는 형태 발생 의 과정을 통해 먼 거리에서 우선 순위의 범위를 정렬하고 표시합니다. 개발 중에 상피의 평면 배열이 어떻게 도달하는지 이해하려면 생체 내에서 높은 간격 측두성 충실도로 셀의 방향과 성장 역학을 추적하는 것이 중요합니다.설명된 프로토콜은 drosophila pupal 표피에서 글로벌 및 로컬 수준에서 세포 행동을 심상 분석하고 분석하도록 설계되었습니다. 이 방법론은 연구, 세포 생물학, 형태 발생 및 평면 극성의 다른 이론에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 다른 조직, 구조 및 모델의 분석에 적용 할 수 있습니다. 모든 단계는 몇 가지 연습 후 쉽게 수행 할 수 있습니다.그들은 정밀도를 요구합니다. 이 프로토콜의 시각화는 짧은 시간 안에 최적의 결과를 달성하는 데 도움이 됩니다. 푸팔 해부는 복잡합니다.먼저 촉촉한 페인트브러시를 사용하여 천막된 흰색 프리푸파를 신선한 플라스틱 바이알로 옮기고 섭씨 25도에서 필요한 기간 동안 보관하십시오. 그런 다음, 집게의 도움으로 유리병의 벽에서 각 새끼를 제거합니다. 양면 스티커 테이프로 덮인 유리 슬라이드에 각 강아지의 복부 측면을 붙입니다.퍼프의 끝과 함께 머리 첨탑과 강아지의 등대 표면을 부드럽게 탭하여 푸팔 케이스의 부착을 테이프에 부착합니다. 포셉으로 퍼파리움에서 오퍼쿨룸을 부드럽게 제거하여 스테레오 현미경으로 해부를 시작합니다. 퍼팔 케이스와 푸파 표면 사이의 얕은 에 집게의 한 끝을 온구 개구부를 통해 삽입합니다.한 개 이상의 스윙에서 머리에서 꼬리까지 케이스를 찢어 내고 푸파를 꼬지 않도록 하십시오. 금이 간 푸팔 케이스를 뒤쪽 끝으로 계속 진행할 때 측면으로 접습니다. 강아지를 강아지를 강아지밑에 조심스럽게 삽입하고 부드럽게 당겨서 푸팔 케이스에서 제거합니다.강아지는 집게의 끝에 붙어 있습니다. 강아지를 복부 쪽으로 부드럽게 잡고, 작은 가스 투과성 할로카본 오일 위에 유리 바닥 접시에 강아지를 옮길. 젖은 티슈 페이퍼를 접시 가장자리에 굴려 서 접시를 덮어 습도를 유지합니다.도메인및 평가 과정에 따라 유리 바닥 접시에 오일 드롭 위에 pupa를 지향한다. 등대 둥지의 초기 확장의 장기 라이브 이미징을 위해, 뒤틀은 pupa를 지향. 그들의 늦은 확장 및 조직 리모델링을 이미지하기 위해, 등등 pupa를 지향.장착된 푸파를 함유한 유리 바닥 접시를 현미경 단계로 옮기고 전염된 빛을 사용하여 복부 영역의 표면에 초점을 맞춥니다. 복부 상피에서 유전 모자이크를 유도하기 위해 미토틱 재조합을 사용하려면 열 충격 유도 불가 플립카제, 특정 게놈 위치에서FRT 부위를 운반하는 처녀 암컷을 준비하고 FRT 부위에 알 수 있는 세포 마커를 증식한다. 동등한 게놈 위치에서 FRT 사이트를 운반하는 돌연변이 수컷을 준비합니다.4~5일 동안 25도의 플라스틱 바이알에서 3~1비율로 여러 여성과 남성을 교차합니다. 히스토아스트에서 체세포 클론을 생성하려면, 45분에서 1시간 동안 37도의 수조에 동물이 함유된 플라스틱 바이알을 침수하여 십자가의 자손의 세 번째 인스타 애벌레 단계에서 열 충격 처리를 수행한다. 이미지 J 소프트웨어에서 최대 강도 프로젝션 기능을 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의해 획득한 Z 스택 조각을 2D로 보호합니다.둥지는 왼쪽과 등쪽의 앞쪽에 평면 좌표 계측기에서 방향을 지정하는 특징적인 모양을 가지고 있습니다. 이 분석을 통해 최적의 결과를 얻으려면 입력 이미지를 고해상도로 획득해야 합니다. 로컬 셀 가장자리에서 정성적 방향 값을 얻으려면 플러그인 메뉴를 클릭하고 방향 J 배포 옵션을 선택합니다.가우시안 창 시그마를 1픽셀로 설정하고, 입방스스라인을 그라데이션으로, 최소 응고도를 20%로, 최소 에너지를 1%로 설정합니다. 플러그인의 색상 측량 옵션을 사용합니다. 색조를 방향, 채도에 대한 채도 및 입력 이미지에 밝기로 설정합니다.이 색상은 세트 평면 좌표 계를 기준으로 셀 에지 방향을 코드로 합니다. 다음으로 플러그인 메뉴에서 방향 J 측정 옵션을 사용하여 셀룰러 방향 방향과 방향 셀을 셀 정렬로 정량화합니다. 히스토아스트가 점유하는 영역 내에서 20 마이크로미터 배 20 마이크로미터 정도의 균일한 무게에 대한 관심의 작고 인접한 비 중첩 영역을 생성합니다.누르면 ROI에서 지배적인 로컬 방향과 일관성이 계산됩니다. 이 연구에서는, 사용되는 방법론은 상당한 사진 표백이나 사진 독성없이 최대 48 시간 동안 개발 강아지의 고해상도 영화를 생성 할 수 있습니다. puparium 형성 후 26 시간에 RFP NLS와 쌍둥이 반점이 없는 것으로 표시된 야생 형 클론의 예가 여기에 표시됩니다.클론은 세그먼트 경계를 따라 길어졌다. 트윈 클론은 병렬 또는 병렬로 배열. 푸파리움 형성 후 26시간 47시간 후 야생형 클론의 형태는 두 단계에서 복잡한 국경 형태를 나타낸다.푸파리움 형성 후 26시간 47시간 후기하학적 매개변수에 대한 상자 및 수염 플롯은 이 시간 창에서 평균 면적과 둘레가 크게 증가함을 보여줍니다. 클론의 방향은 확장 및 리모델링 중에 유지되었습니다. puparium 형성 후 26 시간 및 47 시간에서 모양 매개 변수는 야생 형 클론에서 거의 변경 된 거칠기, 둥글림 및 원형을 나타냅니다.그렇지 않으면 몇 시간 이내에 죽을 것이다, 강아지를 손상시키지 않도록해야합니다, 라이브 이미징에 영향을 미치는. 이 프로토콜은 사투스 시약이나 계측기를 사용할 필요가 없습니다. 해부 할 때 자신을 꼬집지 마십시오.이러한 방법론을 적용하여 다른 상상 기술을 사용하여 장기간 고해상도 영화를 생성할 수 있습니다. 광자 또는 회전 디스크에 초점을 합니다. 클로랄 분석은 임의의 세포가 교차 회담 또는 세포 통신 메커니즘의 식별에서 용이하게하기 때문에 비 자율적 반응을 탐구하기 위해 사용될 수있다.이러한 방법은 변태, 근육 및 변형 시 신경 발달의 조정을 포함하여 형태 유전학 현상의 전체 범위를 연구하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...