Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i Martín-Blanco-laboratoriet för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar också Nic Tapon (The Crick Institute, London, Storbritannien), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) och FlyBase (för Drosophila genanteckning). Federica Mangione stöddes av en JAE-CSIC predocstipendium. Laboratoriet Martín-Blanco finansierades genom Programmeta Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P och BFU2017-82876-P) och från Fundación Ramón Areces.

OBS: Detta protokoll är indelat i fem steg: (1) mellanstationer av poppar, (2) förbereda puppor för bildbehandling, (3) levande bildbehandling av den växande buken epithelia, (4) generering av genetiska mosaiker, (5) databehandling och analys (inklusive avsnitt som beskriver hur man analyserar cellorientering dynamik från cellkorsningkonturering och tillväxtdynamik från cell kloner).
1. Iscensättning av Drosophila puppor före avbildning
<ol><li>Odla flugor av lämplig genot...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

Långväga ordning är en viktig egenskap hos de flesta funktionella fysiologiska enheter. Under morfogenesis uppnås ordning genom integration av komplexa instruktioner som genomförs med hög tidsmässig och rumslig precision. Flera och multilevel begränsningar är integrerade i stereotypa vävnad arrangemang.
Polaritet och riktning är avgörande för ordnade rumsliga arrangemang under utveckling. Polaritet innebär symmetribrott under utveckling. Uppnåendet av asymmetri är nödvändigt ...

För att uppnå sina roller, epitelvävnader helt förlita sig på den rumsliga organisationen av sina cellulära komponenter. I de flesta epithelia, celler är inte bara packade mot varandra för att skapa en exakt kullersten lager men de orienterar sig i förhållande till kroppen axlar.
Den funktionella betydelsen av exakt vävnad organisation är uppenbart i sensorisk epithelia, såsom ryggradsdjur innerörat och näthinnan. I det första fallet, hår och stödjande celler anpassa i en specifik axiell riktning för att effektivt känna av mekaniska ingångar såsom ljud och rörelse1,2. På samma sätt är fotoreceptorcellens rumsliga organisation nödvändig för att uppnå optimala optiska egenskaper vid näthinnan3. Rumslig kontroll av cellens position och orientering är därför av särskild betydelse för korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila är en holometabolous insekt som genomgår en fullständig omvandling av dess larvkroppsstrukturer genom metamorfos, vilket ger upphov till dess vuxna vävnader. Den Drosophila pupa är en utmärkt modell för noninvasive levande bildbehandling av en mängd olika dynamiska händelser, inklusive utvecklingscell migration4, celldelning och tillväxtdynamik5, muskelkontraktion6, celldöd7, sår reparation8, och cell orientering9. I den vuxna Drosophilavisar den yttre epitelen en hög grad av ordning. Detta observeras lätt på arrangemangen av trichomes (dvs. cell utsprång som härrör från enstaka epitelceller) och sensoriska borst över hela flugan kroppsyta10. Faktum är att trichomes är i linje i parallella rader vägledande luftflödet11. Den morphogenesis av den vuxna epithelia och den beställda arrangemang av de enskilda cellerna börjar under embryogenesis och kulminerar under pupal stadier. Även i embryon cell divisioner, intercalations, och form förändringar alla minska vävnad ordning12,13, detta återgått i senare utvecklingsstadier, särskilt i pupal stadier, när flugan närmar mognad9.
Den orörliga Drosophila puppan ger ett idealiskt system för att utvärdera cellens form och orientering förändringar. Pupal abdominal epidermis presenterar speciella fördelar. Medan prekursorer av vuxna huvudet, bröstkorgen, könsorganen, och bihang växa och få mönstrad från larv stadier, histoblaster, som är integrerade i larv epidermis, börja växa och skilja endast på pupariation14. Denna funktion gör det möjligt att spåra alla spatiotemporal händelser som deltar i inrättandet av vävnad ordning i sin helhet9.
Histoblasts anges under embryonal utveckling på kontralateral positioner i varje presumtiva buken segmentet. Den dorsala buken epidermis av den vuxna härrör från dorsolaterally ligger histoblast bon närvarande vid främre och bakre fack15,16. Som histoblaster expandera, ersätter larv epitelceller (LECs), kontralaterala bon säkring vid dorsala mittlinjen bildar en konfluent ark17,18,19,20.
Detta arbete beskriver 1) en metodik för dissekering, montering och långsiktig live imaging av Drosophila pupae och 2) analytiska metoder för att studera dynamiken i cellulär orientering och tillväxt vid hög spatiotemporal upplösning. Ett detaljerat protokoll finns här, som omfattar alla de steg som krävs från den ursprungliga puppor beredning (dvs. mellanstationer och bildbehandling) till extraktion och kvantifiering av riktning och orientering funktioner. Vi beskriver också hur man kan härleda lokala vävnadsegenskaper från analys av cell kloner. Alla de beskrivna stegen är minimalt invasiva och tillåter långsiktiga liveanalyser. De metoder som beskrivs här kan enkelt anpassas och tillämpas på andra utvecklingsstadier, vävnader eller modellorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

Inom flercelliga organismer uppvisar mogna vävnader och organ höga ordningsgrader i de rumsliga arrangemangen av deras beståndsdelar. Ett anmärkningsvärt exempel ges av sensorisk epithelia, där celler av samma eller distinkta identiteter förs samman via cell-cell vidhäftning visar mycket organiserade plana mönster. Cellerna anpassar sig till varandra i samma riktning och visar motsvarande polaritet över stora avstånd. Denna organisation av den mogna epithelia är etablerad under loppet av morphogenesis. För att förstå hur den mogna epithelias plana arrangemang uppnås är det viktigt att spåra cellorientering och tillväxtdynamik med hög spatiotemporal trohet under utveckling in vivo. Robusta analysverktyg är också nödvändiga för att identifiera och karakterisera lokala till globala övergångar. Drosophila pupa är ett idealiskt system för att utvärdera orienterade cell form förändringar underliggande epitelial morphogenesis. Den pupal utvecklande epitel utgör den yttre ytan av den orörliga kroppen, vilket möjliggör långsiktig avbildning av intakta djur. Protokollet som beskrivs här är utformat för att avbilda och analysera cellbeteenden på både globala och lokala nivåer i pupal abdominal epidermis som växer. Den metod som beskrivs kan enkelt anpassas till avbildning av cellbeteenden i andra utvecklingsstadier, vävnader, subcellulära strukturer eller modellorganismer.

Protokollet som beskrivs ovan omfattar beredning av Drosophila puppor för långsiktiga levande bildbehandling och förfarandena för analys av cellorientering och tillväxt dynamik buken epidermis. Genom att tillämpa denna metod är det möjligt att generera högupplösta filmer av den utvecklande poppen under perioder på upp till 48 timmar utan betydande fotobleaching eller fototoxicitet. Ögonblicksbilder som visar bukeeepdermis (t.ex. histoblaster och LECs) vid olika tidpun...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Detta protokoll är utformat för avbildning och analys av dynamiken i cellorientering och vävnad tillväxt i Drosophila buken epithelia som fruktflugan genomgår metamorfos. Den metod som beskrivs här kan tillämpas på studier av olika utvecklingsstadier, vävnader och subcellulära strukturer i Drosophila eller andra modellorganismer.

Imaging och analys av vävnadsorientering och tillväxtdynamik i utvecklande Drosophila Epithelia under pupal stadier

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Inom flercelliga organismer visar vävnad höga grader ytterligare i sin rumsliga orientering. Celler anpassa och visa en rad prioritet över stora avstånd under loppet av morfogenes. För att förstå hur planararrangemangen av Epithelia nås under utvecklingen är det avgörande att spåra cellens inriktningar och tillväxtdynamik med hög spacial temporal trohet in vivo.Det beskrivna protokollet är utformat för att avbilda och analysera cellbeteenden på global och lokal nivå i drosophila-pupal epidermis. Denna metodik kan ge insikter i olika forskningsteori, cellbiologi, morfogen, och planar polaritet och kan tillämpas på analys av andra vävnader, strukturer och modeller. Alla steg kan utföras enkelt efter lite övning.De kräver precision. Visualisering av detta protokoll hjälper till att uppnå optimala resultat på kortare tid. Den pupal dissekering är komplex.Till att börja med använder du en fuktad pensel för att överföra iscensatta vita pre-puppor till en färsk plastflaska, och hålla dem där så länge som behövs vid 25 grader Celsius. Ta sedan bort varje puppar från väggen i injektionsflaskan med hjälp av tuppar. Limma den ventrala sidan av varje pupa på en glasrutschbana täckt med dubbelsidig tejp.Knacka försiktigt på huvudet spiracles och den dorsala ytan av puppan med spetsarna på tärna för att försäkra vidhäftningen av pupal fallet till bandet. Påbörja dissektion under ett stereomikroskop genom att försiktigt ta bort operculumet från pupariumet med tärnorna. Sätt in en spets på tärnarna i en grund mellan pupal-fodralet och poppytan genom operkuläröppningen.Riv fallet från huvud till svans i laterled i en eller flera gungor, undvika nypa puppan. Vik tillbaka den knäckt pupal fall till den laterala sidor som du fortsätter att fortsätta till den bakre änden. Ta bort poppen från det öppnade pupalfallet genom att försiktigt föra in trikrån under djuret och försiktigt dra upp.Puppan fastnar på spets på tniparna. Håll poppan försiktigt vid den ventrala sidan och överför poppan till en glasbottnad skål ovanpå en liten droppe gaspermeabel halocarbonolja. Rulla en bit vått mjukpapper i kanterna på skålen och täck skålen för att upprätthålla luftfuktigheten.Orient puppan över oljedroppen på glasbottnad rätter enligt domänen och den process som skall utvärderas. För långsiktig levande avbildning av den tidiga expansionen av dorsala bon, dorsala i laterled orientera puppan. För att avbilda deras sena expansion och vävnadsremodellering orienterar dorsally puppan.Överför glasbottnad maträtt som innehåller den monterade puppor till mikroskopstadiet och fokusera på bukområdets yta med hjälp av överfört ljus. Att anställa mitotiska rekombination att inducera genetiska mosaiker i buken epitel, förbereda jungfruliga honor som bär en värme chock inducerbara flipas, en FRT plats på en specifik genomisk plats, och en igenkännlig cellulära markör distala till FRT webbplats. Förbered mutanthanar som bär på en FRT-plats på motsvarande genomiska plats.Korsa flera honor och hanar i en tre till en andel i en plastflaska vid 25 grader Celsius i fyra till fem dagar. För att generera somatiska kloner i histoblasterna, utför värmechockbehandling vid det tredje instar larval-stadiet av korsets avkomma genom att dränka plastflaskorna som innehåller djuren i ett vattenbad i 37 grader Celsius i 45 minuter till en timme. I programvaran image J, använd maximal intensitet projektionsfunktion för att skydda Z stack skivor som förvärvats av confocal mikroskopi i 2D.Bonen har en karakteristisk form som orienterar dem i ett planar koordinatsystem anterior till vänster och ryggtill toppen. För att uppnå optimala resultat med denna analys måste indatabilden förvärvas med hög upplösning. För att erhålla kvalitativa orienteringsvärden på lokala cellkanter, klicka på plug-in-menyn och välj alternativet orientering J fördelning.Ställ gaussiska fönstret sigma till en pixel, kubik spline till toning, minsta coherency till 20 procent, och minsta energi till en procent. Använd färgundersökningsalternativet för plugin-programmet. Ange nyans till orientering, mättnad till coherency och ljusstyrka för att mata in bild.Den här färgen kodar cellkantorienteringar i förhållande till det inställda planarkoordinatsystemet. Därefter, under plug-in-menyn, använd alternativet orientering J mått för att kvantifiera cellulära orienteringar och riktningscell till celljustering. Generera små, angränsande icke-överlappande regioner av intresse av enhetlig vikt runt 20 mikrometer gånger 20 mikrometer inom det område som upptas av histoblasterna.Genom att trycka på mått beräknas den dominerande lokala orienteringen och coherency från ROIs. I denna studie, den metod som används kan generera högupplösta filmer av utvecklande puppor för perioder på upp till 48 timmar utan betydande foto blekning eller foto toxicitet. Exempel på vilda typkloner som markeras av frånvaron av RFP NLS och deras tvillingfläckar vid 26 timmar efter pupariumbildningen visas här.Klonerna långsträckta längs segmenternas gränser. Tvillingkloner arrangerade parallellt eller i tandem. Morfologi av en vild typ klon på 26 timmar och 47 timmar efter puparium bildas visar komplexa gränsen morfologi i båda stadierna.Box och morrhår tomter för geometriska parametrar vid 26 timmar och 47 timmar efter puparium bildas visar den genomsnittliga området och omkretsen ökat betydligt i denna tid fönster. Klonens orientering var ihållande under expansion och ombyggnad. Formparametrar vid 26 timmar och 47 timmar efter pupariumbildningen indikerar ojämnhet, rundhet och cirkulärhet som knappt ändrats i vildtypklonsarna.Var noga med att inte skada puppan, annars kommer det att dö inom några timmar, vilket påverkar levande bildbehandling. Detta protokoll kräver inte att ett sartusreagens eller -instrument används. Undvik att nypa dig själv när du dissekerar.Genom att tillämpa dessa metoder möjligt att generera högupplösta filmer för lång sikt perioder med hjälp av olika föreställa tekniker. Fokal till foton eller snurrande diskar. Kloralanalys kan användas för att utforska icke-autonoma svar eftersom slumpmässiga celler underlättar vid identifiering av korssamtal eller cellkommunikationsmekanismer.Dessa metoder kan lätt anpassas för att studera ett komplett utbud av morfogogenetiska fenomen, inklusive samordning av epidermal, muskulös, och neuro utveckling under metamorfos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; PUPP Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Analysera blodcellpopulationer av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder för Imaging intracellulära pH av follikeln Stem Cell härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissektion och färgning av Drosophila Pupp äggstockarna

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Förbereda utveckla perifera Olfactory vävnad för molekylär och immunhistokemisk analys i Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analys av Actomyosin dynamik på lokala cellulära och vävnad skalor med hjälp av Time-lapse filmer av odlade Drosophila ägg kammare

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissektion av Drosophila Pupp näthinnan för immunohistokemi, västra analys och RNA isolering

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...