Name: imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages
Uploaded: 2020-06-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Martín-Blanco laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Nic Tapon (Crick Enstitüsü, Londra, İngiltere), Bloomington Stock Center (University of Indiana, ABD) ve FlyBase (Drosophila gen ek gösterimi için) teşekkür ederiz. Federica Mangione JAE-CSIC doktora öncesi bursu ile desteklendi. Martín-Blanco laboratuvarı Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P ve BFU2017-82876-P) ve Fundación Ramón Areces tarafından finanse edilmiştir.

NOT: Bu protokol beş adıma ayrılır: (1) pupanın evreleme, (2) pupanın görüntüleme için hazırlanması, (3) büyüyen abdominal epitelin canlı görüntülemesi, (4) genetik mozaik lerin üretimi, (5) veri işleme ve analizi (hücre kavşağı anahatlarından hücre oryantasyon dinamiklerinin nasıl analiz edilebildiğini açıklayan bölümler ve hücre klonlarından büyüme dinamikleri dahil).
1. Görüntüleme öncesi Drosophila pupa evreleme
<ol><li>Kültür, 25 °C'de...

<ol>
	<li>Gillespie, P. G., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+by+hair+cells:+models,+molecules,+and+mechanisms.">Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms.</a> Cell. 139, 33-44 (2009).</li><li>Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+form+and+function:+planar+polarity+and+development+of+the+vestibular+maculae.">A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae.</a> Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).</li><li>Stell, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+morphologic+relations+of+rods+and+cones+in+the+retina+of+the+spiny+dogfish,+Squalus.">The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336, 724-727 (2012).</li><li>Puah, W. C., Wasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+muscles+in+Drosophila+metamorphosis:+Towards+high-throughput+gene+identification+and+function+analysis.">Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis.</a> Methods. 96, 103-117 (2016).</li><li>Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+adhesion+and+modulation+of+mechanical+tensile+forces+during+apoptosis+in+Drosophila+epithelium.">Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium.</a> Development. 144, 95-105 (2017).</li><li>Weavers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Analysis+of+the+Dynamic+Inflammatory+Response+to+Tissue+Damage+Reveals+Spatiotemporal+Properties+of+the+Wound+Attractant+Gradient.">Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient.</a> Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).</li><li>Mangione, F., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dachsous/Fat/Four-Jointed+Pathway+Directs+the+Uniform+Axial+Orientation+of+Epithelial+Cells+in+the+Drosophila+Abdomen.">The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen.</a> Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).</li><li>Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+compartments+and+planar+polarity+in+Drosophila.">Developmental compartments and planar polarity in Drosophila.</a> Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).</li><li>Wootton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+flies+fly.">How flies fly.</a> Nature. 400, 112-113 (1999).</li><li>Zallen, J. A., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+gene+expression+directs+bipolar+planar+polarity+in+Drosophila.">Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila.</a> Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).</li><li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epithelia.">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+changes.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes.</a> Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).</li><li>Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+in+the+abdomen+of+Drosophila+and+the+role+of+the+engrailed+locus.">Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus.</a> Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).</li><li>Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+parameters+of+tergite+development+in+Drosophila.">Clonal parameters of tergite development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).</li><li>Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+metamorphosis+of+the+abdominal+histoblasts+of+Drosophila+melanogaster.">Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).</li><li>Madhavan, M. M., Madhavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+epidermis+of+adult+abdomen+of+Drosophila.">Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries.">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40, 2552-2556 (2009).</li><li>Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+elastin+anisotropy+in+structural+strain+energy+functions+of+arterial+tissue.">Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).</li><li>Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+paleontological+statistics+software+package+for+education+and+data+analysis.">PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis.</a> Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).</li><li>Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity:+coordinating+morphogenetic+cell+behaviors+with+embryonic+polarity.">Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity.</a> Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).</li><li>Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Somatic+Adult+Tissues+Develop+Organizer+Activity.">How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).</li><li>Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+tissue-scale+forces+drive+oriented+junction+growth+during+tissue+extension.">Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension.</a> Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).</li><li>Martin-Blanco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=puckered+encodes+a+phosphatase+that+mediates+a+feedback+loop+regulating+JNK+activity+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila.</a> Genes and Development. 12, 557-570 (1998).</li><li>Dye, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+underlying+oriented+growth+of+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144, 4406-4421 (2017).</li><li>Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-mediated+two-step+mechanism+is+required+for+ventral+enclosure+of+the+C.+elegans+hypodermis.">An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis.</a> Development. 124, 2889-2901 (1997).</li><li>Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palate+development.">Palate development.</a> Development. 103, 41-60 (1988).</li></ol>

Uzun menzilli düzen en fonksiyonel fizyolojik birimlerin temel bir özelliğidir. Morfogenez sırasında, yüksek zamansal ve mekansal hassasiyetle uygulanan karmaşık talimatların entegrasyonu ile düzen elde edilir. Çoklu ve çok düzeyli konsuşlar stereotipli doku düzenlemelerine entegre edilmiştir.
Polarite ve yönlülük gelişim sırasında düzenli mekansal düzenleme için çok önemlidir. Polarite gelişme sırasında simetri kırılması anlamına gelir. Embriyonik anteroposte...

Rollerini başarmak için, epitel dokular tamamen hücresel bileşenlerinin mekansal organizasyon güveniyor. Epitelin çoğunda hücreler sadece kesin bir parke taşı tabakası oluşturmak için birbirlerine karşı paketlenmezler, aynı zamanda vücut eksenlerine göre kendilerini yönlendirirler.
Omurgalı iç kulak ve retina gibi duyusal epitelde hassas doku organizasyonunun fonksiyonel önemi açıktır. İlk durumda, saç ve destekleyici hücreler ses ve hareket1gibi mekanik girdileri verimli bir şekilde algılamak için belirli bir eksenel yönde hizalamak1 ,2. Benzer şekilde, fotoreseptör hücre mekansal organizasyonretina3 tarafından optimum optik özellikleri elde etmek için gereklidir. Hücre pozisyonu ve oryantasyonuz mekansal kontrolü böylece uygun fizyolojik fonksiyon için özel bir alaka olduğunu.
Drosophila, larva vücut yapılarının metamorfoz yoluyla tamamen dönüşümüne neden olan ve erişkin dokularına yol açan holometabolöz bir böcektir. Drosophila pupa dinamik olayların çeşitli noninvaziv canlı görüntüleme için mükemmel bir modeldir, gelişimsel hücre göçü dahil4, hücre bölünmesi ve büyüme dinamikleri5, kas kasılması6, hücre ölümü7, yara onarımı 8, ve hücre oryantasyonu9. Yetişkin Drosophilaolarak , dış epitel sipariş yüksek derecede gösterir. Bu kolayca trichomes düzenlemeleri gözlenir (yani, tek epitel hücrelerinden kaynaklanan hücre çıkıntıları) ve duyusal kıllar sinek vücut yüzeyinde10. Nitekim, trichomes paralel satırlar hava akımı11rehberlik hizalanır. Erişkin epitelinin morfogenezi ve tek tek hücrelerin düzenli düzenlenmesi embriyogenez sırasında başlar ve pupal evrelerinde doruğa ulaşır. Embriyolarda hücre bölünmeleri, intercalations, ve şekil değişiklikleri tüm doku düzeni azaltmakiken 12,13, Bu gelişmenin daha sonraki aşamalarında geri, özellikle pupal aşamalarında, sinek olgunluğa yaklaştığında9.
Hareketsiz Drosophila pupa hücre şekli ve oryantasyon değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistem sağlar. Pupal abdominal epidermis özel avantajlar sunar. Yetişkin baş öncüleri, toraks, genital, ve uzantıları büyümek ve larva aşamalarından desenli olsun iken, larva epidermis entegre histoblastlar, büyüyen başlar ve sadece pupariation farklılaşma14. Bu özellik, doku düzeninin kurulmasında rol oynayan tüm spatiotemporal olayların tümünün izlenmesine olanak sağlar9.
Histoblastlar her varsayımsal abdominal segmentte kontralateral pozisyonlarda embriyonik gelişim sırasında belirtilir. Erişkin dorsal abdominal epidermis dorsolaterally anterior ve posterior bölmeleri mevcut histoblast yuvaları bulunan türetilmiştir15,16. Histoblastlar genişledikçe, larva epitel hücreleri (LECs) yerine, konfluent levha oluşturan dorsal orta hat kontralateral yuvaları sigorta17,18,19,20.
Bu çalışma 1) Drosophila pupa diseksiyon, montaj ve uzun vadeli canlı görüntüleme için bir metodoloji açıklar, ve 2) yüksek spatiotemporal çözünürlükte hücresel oryantasyon ve büyüme dinamiklerini incelemek için analitik yöntemler. Burada, ilk pupa hazırlığından (evreleme ve görüntüleme) yönlülük ve oryantasyon özelliklerinin çıkarılması ve ölçülmesi için gerekli tüm adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca hücre klonları analizinden yerel doku özelliklerini nasıl çıkarabileceğimizi de açıklıyoruz. Açıklanan tüm adımlar minimal invazivdir ve uzun süreli canlı analizlere olanak sağlar. Burada açıklanan yöntemler kolayca adapte edilebilir ve diğer gelişim evrelerine, dokulara veya model organizmalara uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>-</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Analyzing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>Atpa::GFP</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila</td>
			<td>hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting pupae for data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>mounting pupae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>Data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the pupae during dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and analysis of tissue orientation and growth dynamics in the developing drosophila epithelia during pupal stages

Çok hücreli organizmalar içinde, olgun doku lar ve organlar kurucu hücrelerinin mekansal düzenlemelerinde yüksek derecede düzen gösterirler. Dikkat çekici bir örnek duyusal epitel tarafından verilir, aynı veya farklı kimlikleri nhücreleri son derece organize düzlemsel desenler gösteren hücre-hücre adezyonu ile bir araya getirilir. Hücreler birbirlerine aynı yönde hizalanır ve büyük mesafelerde eşdeğer polarite görüntüler. Olgun epitelin bu organizasyonu morfogenez boyunca kurulmuştur. Olgun epitelin düzlemsel düzenlemesinin nasıl sağlandığını anlamak için, in vivo gelişimi sırasında hücre oryantasyonve büyüme dinamiklerini yüksek spatiotemporal sadakatle izlemek çok önemlidir. Yerelden küresele geçişleri tanımlamak ve tanımlamak için sağlam analitik araçlar da gereklidir. Drosophila pupa epitel morfogenez altında yatan yönelimli hücre şekli değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistemdir. Pupal gelişen epitel hareketsiz vücudun dış yüzeyini oluşturur, bozulmamış hayvanların uzun süreli görüntülenmesi sağlar. Burada açıklanan protokol, büyüdükçe pupal abdominal epidermiste hem küresel hem de lokal düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Açıklanan metodoloji, diğer gelişim evrelerinde, dokularda, hücre altı yapılarda veya model organizmalarda hücre davranışlarının görüntülenmesine kolayca adapte edilebilir.

Yukarıda açıklanan protokol, Drosophila pupasının uzun süreli canlı görüntüleme için hazırlanmasını ve karın epidermisinin hücre oryantasyon ve büyüme dinamiklerinin analizini kapsamaktadır. Bu metodolojiyi uygulayarak, gelişmekte olan pupanın yüksek çözünürlüklü filmlerini, önemli bir fotobeyazrlama veya fototoksisite olmaksızın 48 saate kadar çıkarmak mümkündür. Karın epidermisini (örneğin histoblastlar ve LED'ler) farklı zaman noktaları...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages at JoVE.com

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Çok hücreli organizmalar içinde, doku uzamsal yönelimlerinde yüksek dereceleri daha fazla gösterir. Hücreler, morfogenez boyunca büyük mesafelerde bir dizi öncelik gösterir ve hizalar. Epitelin düzlemsel düzenlemelerinin gelişim sırasında nasıl ulaştığını anlamak için, hücrenin oryantasyonlarını ve büyüme dinamiklerini yüksek aralıklı zamansal doğrulukla izlemek çok önemlidir.Açıklanan protokol drosophila pupal epidermis küresel ve yerel düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu metodoloji farklı araştırma kuramı, hücre biyolojisi, morfogenez ve düzlemsel polarite hakkında bilgi verebilir ve diğer dokuların, yapıların ve modellerin analizine uygulanabilir. Tüm adımlar bazı uygulamadan sonra kolayca gerçekleştirilebilir.Kesinlik istiyorlar. Bu protokolün görselleştirilmesi, en iyi sonuçların daha kısa sürede elde edilebilmesine yardımcı olur. Pupal diseksiyonu karmaşıktır.Başlamak için, taze bir plastik şişe için sahnelenen beyaz pre-pupa aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın ve 25 santigrat derece gerekli olduğu sürece onları tutmak. Sonra, forceps yardımıyla şişe duvarından her pupa çıkarın. Çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir cam slayt üzerinde her pupa ventral tarafı tutkal.Pupal kasanın banda yapışmasını sağlamak için pupanın uçlarıyla baş spiracles'e ve pupanın sırt yüzeyine hafifçe dokunun. Operkülonu puparium'dan forceps ile hafifçe çıkararak stereo mikroskop altında diseksiyonun diseksiyona başlayın. Operküler açıklık yoluyla pupal durumda ve pupa yüzeyi arasında sığ bir forceps bir ucu yerleştirin.Bir veya daha fazla salıncakta kılıfı baş lardan kuyrağa yırtarak pupayı çimdiklemekten kaçının. Arka uça doğru devam ederken kırık pupal kılıfı lateral kenarlara katlayın. Pupayı, hayvanın altına dikkatlice sokarak ve yavaşça yukarı çekerek açılan pupal kasadan çıkarın.Pupa, ponpların ucuna yapışır. Pupayı ventral tarafta hafifçe tutun ve pupayı gaz geçirilebilir halokarbon yağının küçük bir damlasının üzerine cam dipli bir tabağa aktarın. Yemeğin kenarlarında ıslak mendil kağıt bir parça rulo ve nem korumak için çanak kapağı.Dibine bünyedeki tabakların üzerindeki yağ damlası üzerine pupa nın üzerine yönlendirin etki alanına ve sürece göre değerlendirilecektir. Dorsal yuvaların erken genişlemesinin uzun süreli canlı görüntülemeiçin, dorsal yanal pupa yönlendirmek. Geç genişleme ve doku remodeling görüntü için, dorsally pupa yönlendirmek.Monte edilmiş pupa içeren cam dipli kabı mikroskop aşamasına aktarın ve aktarılan ışığı kullanarak karın bölgesinin yüzeyine odaklanın. Karın epitelinde genetik mozaikleri indüklemek için mitotik rekombinasyon kullanmak için, ısı şoku indüklenebilir flipaz, belirli bir genomik konumda bir FRT bölgesi ve FRT bölgesine tanınabilir hücresel marker distal taşıyan bakire dişileri hazırlayın. Eşdeğer genomik konumda FRT alanı taşıyan mutant erkekleri hazırlayın.Dört ila beş gün boyunca 25 santigrat derece bir plastik şişe üç-bir oranda birkaç kadın ve erkek çapraz. Histoblastlarda somatik klonlar oluşturmak için, 37 santigrat derecede hayvanları içeren plastik şişeleri bir saate 45 dakika ila 45 dakika sallayarak haçın soyundan gelen üçüncü yıldız larva evresinde ısı şoku tedavisi yapın. Görüntü J yazılımında, 2B konfokal mikroskopi ile elde edilen Z yığın dilimlerini korumak için maksimum yoğunluklu projeksiyon işlevini kullanın.Yuvalar, onları düzlemsel koordinat sistemi ön solunda ve sırtüstü doğru yönlendiren karakteristik bir şekle sahiptir. Bu analizle en iyi sonuçları elde etmek için giriş görüntüsünün yüksek çözünürlükte elde edilmesi gerekir. Yerel hücre kenarlarında nitel yönlendirme değerleri elde etmek için eklenti menüsüne tıklayın ve yön J dağıtım seçeneğini seçin.Gausspencere sigmasını bir piksele, kübik spline degradeye, minimum tutarlılığı yüzde 20'ye ve minimum enerjiyi yüzde bire ayarlayın. Eklentinin renk etüdü seçeneğini kullanır. Tonunu yönlendirmeye, doygunluğu tutarlılığa ve giriş görüntüsüne parlaklık olarak ayarlayın.Bu renk, hücre kenarı yönünü ayarlanan düzlemsel koordinat sistemine göre kodlar. Ardından, eklenti menüsüaltında, hücresel yönlendirmeleri ve yön hücresini hücre hizasına göre ölçmek için yön J ölçüsü seçeneğini kullanın. Histoblastların işgal ettiği alan içinde 20 mikrometre çarpı 20 mikrometre civarında tek tip ağırlığın ilgi küçük, bitişik örtüşen olmayan bölgeleri oluşturun.Presleme ölçüsü, ROI'ların baskın yerel yönünü ve tutarlılığını hesaplar. Bu çalışmada, kullanılan metodoloji önemli fotoğraf ağartma veya fotoğraf toksisitesi olmadan 48 saate kadar süreler için gelişmekte olan pupa yüksek çözünürlüklü filmler üretmek mümkün. Burada, rfp NLS'nin yokluğunda işaretlenen yabani tip klonlar ve ikiz noktalarının puparium oluşumundan 26 saat sonra gösterilmektedir.Klonlar segmental sınırlar boyunca uzamış. İkiz klonlar paralel veya birlikte düzenlenmiştir. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra vahşi tip bir klonun morfolojisi her iki aşamada da karmaşık sınır morfolojisi gösterir.Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra geometrik parametreler için kutu ve bıyık çizimleri ortalama alan ve çevre nin bu zaman penceresinde önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Klonun oryantasyonu genişleme ve yeniden şekillendirme sırasında sürdürüldü. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra şekil parametreleri, yabani tip klonlarda pürüzlülük, yuvarlaklık ve daireselliğin zar zor değiştiğini gösterir.Pupa zarar değil emin olun, aksi takdirde birkaç saat içinde ölecek, canlı görüntüleme etkileyen. Bu protokol, sartus reaktifinin veya enstrümanın çalıştırılmasını gerektirmez. Parçalara ayırırken kendinizi çimdiklemekten kaçının.Bu metodolojileri uygulayarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü filmler üretmek için farklı hayal teknikleri kullanarak mümkün. Fotonların veya dönen disklerin odaknoktası. Rastgele hücreler çapraz görüşmeler veya hücre iletişim mekanizmalarının belirlenmesinde kolaylık sağladığından, otonom olmayan yanıtları araştırmak için klorsal analiz kullanılabilir.Bu yöntemler kolayca morfogenetik olayların tam bir dizi çalışma için adapte edilebilir, metamorfoz sırasında epidermal koordinasyonu da dahil olmak üzere, kas, ve nöro gelişim.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Periferik koku doku için geliştirme hazırlanıyor moleküler ve immunohistokimyasal Drosophila analizde

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...