Name: time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

ويدعم هذا العمل برنامج البحوث داخل الجدارية التابع للمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة. المشروع رقم 1ZIANS003137.

تحذير: </</c0> وينطوي هذا البروتوكول على استخدام أشعة الليزر من الفئة الرابعة، وسيتطلب اتباع مبادئ توجيهية مناسبة للتدريب والسلامة. تجنب التعرض للعين أو الجلد لضوء الليزر المباشر أو المتناثر. ملاحظة: ويتضمن البروتوكول ست خطوات. يظهر سير العمل في الشكل 1<str...

<ol>
	<li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis.">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li><li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation.">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).</li><li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input:+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis.">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li><li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster.">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+larval+visual+system:+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil.">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li><li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System.">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li><li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis.">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity.">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li><li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila.">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li><li>del Valle Rodr&#237;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47 (2011).</li><li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions:+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia.">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li><li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+optical+imaging+of+nervous+system+development.">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression.">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Urban&#269;i&#269;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodyan:+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia.">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li></ol>

هنا، ونحن نصف بروتوكول وضعنا لتسجيل وقياس السلوك الديناميكي للفروع dendritic في الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي في العقول اليرقات Drosophila. وتجدر الإشارة إلى أن بروتوكول التصوير الحي لدينا يحتوي على معلمات محددة تمكننا من التقاط الشجرة الددرية الكاملة لـ LNv اليرقات وتوفير رؤية عالمية لل?...

Dendrites هي مقصورات الخلايا العصبية المتخصصة التي تتلقى ومعالجة المدخلات الحسية ومتشابك. ويجري التحقيق المكثف في الهيكل المعقد والنمطي للأشجار التقشرية منذ اكتشافها. وقد تم إنشاء عدد من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا العصبية الكتيكة البصرية Xenopus، وخلايا العقدة الشبكية الفرخ، والخلايا العصبية التأرّب التقشري (دا) في نظام دروسوفيلا، لدراسة تطوير وإعادة عرض واللدونة من الدنتيريات العصبية1،2،3،4. دروسوفيلا الخلايا العصبية الجانبية البطني (LNvs) هي مجموعة من الخلايا العصبية الإسقاط البصرية التي تم تحديدها في البداية لوظائفها الهامة في تنظيم circadian من السلوكيات يطير5. كما كشفت الدراسات عن دور اليرقات LNvs كهدف مباشر للمستقبلات الضوئية لليرقات (PRs)6،7. الأهم من ذلك، زراعة اليرقات النامية في أنظمة ضوء مختلفة يؤثر بقوة على حجم الأشجار الدنية LNvs ' ، مما يدل على ملاءمة LNvs كنموذج جديد لدراسة اللدونة الدنيستيك7. العمل الأخير من مجموعتنا يشير كذلك إلى أن كلا من حجم dendrite LNv والسلوك الديناميكي للفروع dendritic عرض اللدونة تعتمد على الخبرة8،9. كجزء من هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للتصوير الحي والقياس الكمي لإجراء تحليل على ديناميات dendrite من LNvs من 2nd أو 3rd اليرقات instar.
الطبيعة الشفافة للدماغ اليرقات Drosophila يجعلها مثالية للتصوير الحي. ومع ذلك، تقع الأشجار الدنية من LNvs في اليرقات اللامعية بكثافة اليرقات العصبية البصرية (LON) في وسط فص الدماغ اليرقات6. لالتقاط صور من فروع الدندرية الدقيقة وfilopodia في أنسجة الدماغ سليمة، ونحن نستخدم اثنين من الفوتون المجهري، مما يزيد من عمق اختراق الضوء ويقلل من السمية الضوئية خلال تجارب التصوير الحي10. باستخدام هذا الإعداد، قمنا بنجاح بإجراء تجارب التصوير الحي على LNvs لأكثر من 30 دقيقة دون مراقبة التدهور المورفولوجي الواضح للخلية العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التلاعبات الوراثية باستخدام تقنية الوجه تمكننا من تسمية LNvs الفردية مع غشاء الموسومة GFP، وهو أمر بالغ الأهمية أيضا لرصد تحركات الفروع الفردية11،12،13 .
لالتقاط السلوك الديناميكي لجميع الفروع على الشجرة dendritic LNv مع القرار البصري الأمثل، قمنا بإجراء التصوير 3D الفاصل الزمني على explants الدماغ اليرقات تشريح حديثا مع دقة مكانية عالية في 1 دقيقة لكل إطار لمدة 10 إلى 30 دقيقة. dendrites هي ديناميكية للغاية، مع نسبة كبيرة من الفروع عرض تغييرات يمكن ملاحظتها داخل نافذة 10 دقيقة. وهذا يؤدي إلى واحدة من التحديات التقنية الرئيسية في دراسة ديناميات dendrite، وتحديد سلوك الفرع استنادا إلى مجموعات بيانات الصورة 4D. وللأساليب المعمول بها سابقا قيود مختلفة، بما في ذلك عدم الدقة والإفراط في متطلبات الوقت. لذلك، قمنا بتطوير طريقة شبه تلقائية تجمع بين معالجة الصور اللاحقة، ووضع العلامات اليدوية على محطات الفروع، وتتبع تلقائي لبقعة 4D باستخدام برنامج تعليق توضيحي للصور. نقوم بحساب تحركات محطات الفروع في نقاط زمنية مختلفة استنادًا إلى إحداثيات الـ 3D للبقع. ثم يتم تصدير البيانات وتحليلها لإنتاج قياسات كمية لديناميات الفرع. هذا الأسلوب يقيّم بدقة مدة ومدى التمديد والتراجع الأحداث من الفروع القائمة، فضلا عن تشكيل فروع جديدة، مما يسمح لنا لمراقبة ديناميات dendrite في عدد كبير من الخلايا العصبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision II multiphoton laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>79751-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>upright configuration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>for processing .csv files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Professional</td>
			<td colspan="2">Scientific Volume Imaging</td>
			<td>for drift correction and deconvolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for 3D visualization and image annotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse live imaging and quantification of fast dendritic branch dynamics in developing drosophila neurons

فيلبوديا الددرية المنستيرية للغاية موجودة على نطاق واسع في الخلايا العصبية في مراحل النمو المبكرة. هذه الفروع الحيوية الاستكشافية عينة البيئة المحيطة وبدء اتصالات مع الشركاء متشابك المحتملة. على الرغم من أن العلاقة بين ديناميات الفروع التقشرية ومتشابك اتّهار، إلا أن كيف أن العمليات التنموية والمعتمدة على النشاط تنظم ديناميات الفروع التقشرية غير مفهومة جيداً. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات التقنية المرتبطة بالتصوير الحي والتحليلات الكمية لهذه الهياكل الدقيقة باستخدام نظام في الجسم الحي. أنشأنا طريقة لدراسة ديناميات dendrite باستخدام الخلايا العصبية الجانبية الجانبية النترجية اليرقات Drosophila (LNvs)، والتي يمكن أن توصف بشكل فردي باستخدام النهج الوراثية ويمكن الوصول إليها للتصوير الحي. الاستفادة من هذا النظام، وضعنا بروتوكولات لالتقاط ديناميات فرع من شجرة dendritic كله من LNv واحد المسمى من خلال التصوير الحي الفاصل الزمني. ثم قمنا بإجراء ما بعد المعالجة لتحسين جودة الصورة من خلال تصحيح الانجراف وdeconvolution، تليها تحليل ديناميات فرع على مستوى فرع واحد من خلال تحديد المواقع المكانية لجميع محطات الفروع. وأخيراً، قمنا بتطوير البرامج النصية R(الملف التكميلي)ومعلمات محددة لتحديد ديناميات الفروع باستخدام معلومات الإحداثيات التي تم إنشاؤها بواسطة تتبع المحطة الطرفية. بشكل جماعي، يسمح لنا هذا البروتوكول لتحقيق وصف كمي مفصل لديناميات فرع الشجرة التقشرية العصبية مع دقة زمنية ومكانية عالية. الأساليب التي طورناها تنطبق عموما على الخلايا العصبية قليلة المسمى في كل من المختبر وفي ظروف الجسم الحي.

باستخدام بروتوكول التصوير الحي الموضح أعلاه، نقوم بالتقاط مكدسات صور عالية الدقة للتحليلات اللاحقة والقياس الكمي. يُظهر الفيديو التكميلي 1 الحد الأقصى للكثافة المتوقعة (MIP) سلسلة الصور التي تم جمعها من ممثل يحمل اسم LNv بشكل فردي. في كلا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons at JoVE.com

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

هنا، نقوم بوصف الطريقة التي استخدمناها لتصوير فيلوبوديا الددرية المنوية في إعداد مباشر لدماغ اليرقات دروسوفيلا، والبروتوكول الذي قمنا بتطويره لتحديد مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد الفاصلة زمنياً للتقييمات الكمية للدندريت ديناميات في تطوير الخلايا العصبية.

الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

يوفر هذا البروتوكول نهجًا جديدًا لتحديد ديناميات الفرع في arbor المتسخ وتطوير الخلايا العصبية باستخدام التصوير المباشر لفاصل الوقت وبرنامج شرح صورة ثلاثية الأبعاد. هذه التقنية صور وتتبع المحطات الفرعية توفير طريقة سريعة وفعالة لقياس السلوكيات الديناميكية من الفيلوبوديا التشجر. توفر الأبحاث التي تستخدم هذه الطريقة نظرة ثاقبة على فهم كيفية تنظيم التطوير والنشاط لتحول التشعب.طرقنا قابلة للتطبيق على الخلايا العصبية المسماة قليلة في كل من في المختبر وفي إعدادات الجسم الحي. عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أنه يجب تعديل معلمات التصوير بعناية لتحقيق دقة زمنية ومكانية كافية. لحصاد العقول من drosophila اليرقات، تحت مجهر تشريح استخدام زوج واحد من عدد خمسة أصابع تشريح تلميح القياسية لعقد عينة اليرقات في مكان أثناء استخدام الآخر لتشريح بعناية الدماغ، والحفاظ على أقراص العين، فصوص الدماغ، والحبل العصبي البطني.ثم قم بإزالة العضلات المرفقة لتقليل أي حركة للعينة أثناء التصوير. عندما تم حصاد كل من العقول، واستخدام الشحوم فراغ لرسم غرفة مربعة على شريحة زجاجية وإضافة 20 ميكرولترات من محلول ملحي خارجي إلى الغرفة. استخدام ملقط لنقل العقول إلى الغرفة وضبط مواقف من العقول تحت المجهر مع الجانبين الظهرية التي تواجه.غطي الغرفة بزلة غلاف زجاجي واضغط بلطف على زلة الغطاء لتقليل الانجراف للعينة أثناء إجراء التصوير. لتحديد explants الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية المسمى بشكل فردي، في غضون 30 دقيقة من تشريح حدد هدف غمر الماء 40X ومصدر ضوء epifluorescence. حدد ليزر فوتون ضبطها إلى 920 نانومتر وجهاز الكشف غير Dscan وتعيين المعلمات التصوير لجمع الصور في 512 في 512 بكسل لكل إطار ودقيقة واحدة لكل Z كومة لمدة 10 دقائق.ثم، ضبط التكبير البصري والرقمي لتحقيق ما يكفي X، Y، Z القرار مع ضمان تغطية كامل arbor dendritic في غضون دقيقة واحدة. وسوف تولد الإعدادات الصور مع نموذجي X، ص، Z القرار من 0.11 في 0.11 في 0.25 ميكرومتر. لتصحيح الانجراف، افتح الملف الذي يهمك في برنامج تصحيح انجراف مناسب وانقر على تحرير وتحرير المعلمات المجهرية.تعيين نوع المجهر إلى حقل واسع لصورتين الفوتون إذا كان هناك خيار فوتون اثنين واتبع سير العمل المعرفة من قبل البرنامج. لdethonvolution، فتح الصورة المصححة الانجراف في برنامج فك التشفير واتبع سير العمل. ثم احفظ الصورة deconvolved في نوع ملف معتمد من قبل برنامج التعليق التوضيحي الصورة اللاحقة قادرة على تحليل البيانات 4D والإبلاغ عن الإحداثيات المكانية من البقع المعرفة داخل الصورة.للتعليق التوضيحي للصورة، افتح الصورة deconvolved في برنامج التعليق التوضيحي للصورة وتفحص وعلامة نصائح الفرع في جميع النقاط الزمنية في 3D. سيقوم برنامج التعليق التوضيحي للصورة بالإبلاغ عن الإحداثيات المكانية والزمانية لنصائح الفرع المميزة وتخزينها. تصدير معلومات الإحداثيات كملف CSV من أجل الحسابات اللاحقة.في الوحدة النمطية البقع، انقر فوق تخطي إنشاء تلقائي، تحرير يدوياً، ثم تحقق من خانة الاختيار التوصيل التلقائي إلى بقعة محددة. راجع الإطارات في السلسلة الزمنية وحدد فرع للتعليق التوضيحي. اضغط على مفتاح Shift، انقر فوق طرف الطرف الطرفي الفرعي لإضافة بقعة.ثم انقر فوق علامة التبويب إحصائيات، حدد مفصلة، وقيم محددة، والموضع. سيتم عرض معلومات الإحداثيات المكانية والزمانية المسجلة. انقر فوق حفظ لتصدير البيانات كملف CSV.لحساب موضع طرف الفرع في 3D، افتح ملف CSV كجداول بيانات وحدد عمود "معرف المسار". انقر فوق فرز أصغر إلى أكبر وقبول توسيع التحديد. بعد الفرز، معرف المسار سوف تحدد كل فرع dendritic فريدة من نوعها والبقع من نفس الفرع حصة نفس المسار ID.The الوقت العمود سيتم تخزين المعلومات من أطر زمنية مختلفة.في جدول البيانات، أضف عمود المسافة، واستخدم الإحداثيات لحساب المسافة لكل نقطتين متجاورتين زمنيًا. لقياس الحركات الطفيفة عند مستوى voxel واحد، قم بإعادة تعيين كل قيم المسافة التي تقل عن 0.3 ميكرومتر لتصفية أي تعليق توضيحي غير مصحح للصورة أو غير كامل. بعد ذلك، قم بإنشاء عمود إزاحة ثم نسخ القيم من عمود المسافة إلى العمود الإزاحة.تعيين أحداث التمديد والسحب يدويًا لكل طرف فرع. إذا كان امتداداً، اترك قيمة النزوح الإيجابية دون تغيير. إذا كان التراجع، تغيير قيمة إزاحة المقابلة إلى قيمة سالبة.ثم، في عمود حدث جديد، جمع قيم الإزاحة لأحداث التمديد والسحب الفردية. في هذا الفيديو، يمكن ملاحظة سلسلة صور متوقعة بالحد الأقصى للكثافة تم جمعها من خلية عصبية جانبية مُنَتَسمة بشكل فردي. تسمح صور الإطار الواحد بتقييم أحداث التراجع والامتداد.يسمح التتبع رباعي الأبعاد شبه المميّس لمحطات الفروع بالشرح التوضيحي لمحطات الفروع الديناميكية للخلايا العصبية الجانبية البطنية المسماة بشكل فردي كما هو موضح. حساب اتجاه ومسافة حركات الفرع في كل نقطة زمنية يسمح مقارنة ديناميات فرع التشعب لالخلايا العصبية الجانبية البطيني المسمى بشكل فردي في مراحل مختلفة من النمو. الخطوة الأكثر أهمية هي الحفاظ على سلامة أنسجة المخ وdendrite مورفيلوري أثناء تشريح وتركيب.جودة سلسلة الصور الخام هي أيضا حاسمة لنجاح التتبع وتحديد الكم. باستخدام هذه التقنية اكتسبنا القدرة على إجراء تحليل كمي للdendrite filopodia في تطوير الخلايا العصبية المركزية drosophila واستكشاف الآلات الجزيئية المتعلقة النضج dendrite وsasaptogenesis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

تحليل الصرف العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لؤلؤ

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

حفز النمو في الخلايا العصبية شجيري متعاطف مثقف

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...